Оценка частоты мутаций у бактерий с помощью анализа на бета-глюкозидазу

Возьмите культуру генетически модифицированных бактерий.

Бактерии индуцируются к экспрессии мутантного варианта ДНК-полимеразы с дефектной корректурной активностью, что увеличивает вероятность ошибки репликации.

Эти ошибки могут привести к спонтанным мутациям в регуляторной области, которые депрессируют ген бета-глюкозидазы и запускают экспрессию фермента бета-глюкозидазы.

Собирайте образцы через равные промежутки времени и оценивайте количество поколений бактерий в каждой культуре. Центрифугируйте образцы и выбросьте надосадочную жидкость.

Снова суспендируйте гранулу в буфере.

Добавьте проникающий раствор и перемешайте, чтобы проникнуть на бактериальную мембрану.

Перенесите пропитанные образцы бактерий на многолуночный планшет.

Добавьте субстрат, который проникает в организм бактерий и вступает в реакцию с ферментом бета-глюкозидазы, образуя окрашенный продукт.

Измерьте интенсивность цвета, чтобы определить активность бета-глюкозидазы.

Проанализируйте активность бета-глюкозидазы в бактериальных культурах, чтобы определить частоту мутаций в разных поколениях.

Перенесите одну колонию E. coli TOP10, содержащую векторы pBAD-ε и pGOOD1-εD12A11, в один миллилитр LB-среды, обработанной антибиотиками.

Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующее утро разведите предкультуру 1 к 250 в трех колбах, содержащих 10 миллилитров свежей среды. Добавьте индукторы по одному миллимоляру арабинозы, IPTG или арабинозы и IPTG и инкубируйте индуцированную культуру при 37 градусах Цельсия в течение восьми часов.

Параллельно подготавливайте неиндуцированные культуры. Соберите один миллилитр аликвот и разведите их один к 500 в новых колбах, содержащих 10 миллилитров свежей среды, дополненной или не дополненной индукторами. Затем инкубируйте смесь в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день повторите действия, начиная с разведения предкультуры, и соберите один миллилитр аликвот. Затем аликвоты помещаются в морозильную камеру.

Далее определите количество поколений, которые произошли в каждой культуре. Перенесите 100 микролитров соответствующих последовательных разведений посевного материала и культуры на ЛБ-планшеты.

Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующее утро пересчитайте колонии на листах LB.

Рассчитайте логарифм числа клеток, присутствующих в посевном материале или log I и в культуре в конце роста или log C, и определите число поколений.

Затем центрифугируют культуру при давлении 5000 г в течение 20 минут и ресуспендируют клетки в одном миллилитре 50 миллимолярного трис HCL, pH 7,6, 50 миллимолярного NaCl.

Чтобы проникнуть в клетки, добавьте две-три капли хлороформа и вортекса на 20 секунд.

Наконец, определите глюкозидазную активность каждой аликвоты в 96-луночном микропланшете.

Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров пермеабилизированных клеток и по 100 микролитров субстрата, использующего-нитрофенил-D-глюкопиранозид, избегая при этом образования пузырьков воздуха в лунках.

Считывайте поглощение на 420 нанометрах с помощью считывателя микропланшетов и фильтра.