Оценка частоты мутаций у бактерий с помощью анализа на бета-глюкозидазу

Возьмите культуру генетически модифицированных бактерий.

Бактерии индуцируются к экспрессии мутантного варианта ДНК-полимеразы с дефектной корректурной активностью, что увеличивает вероятность ошибки репликации.

Эти ошибки могут привести к спонтанным мутациям в регуляторной области, которые депрессируют ген бета-глюкозидазы и запускают экспрессию фермента бета-глюкозидазы.

Собирайте образцы через равные промежутки времени и оценивайте количество поколений бактерий в каждой культуре. Центрифугируйте образцы и выбросьте надосадочную жидкость.

Снова суспендируйте гранулу в буфере.

Добавьте проникающий раствор и перемешайте, чтобы проникнуть на бактериальную мембрану.

Перенесите пропитанные образцы бактерий на многолуночный планшет.

Добавьте субстрат, который проникает в организм бактерий и вступает в реакцию с ферментом бета-глюкозидазы, образуя окрашенный продукт.

Измерьте интенсивность цвета, чтобы определить активность бета-глюкозидазы.

Проанализируйте активность бета-глюкозидазы в бактериальных культурах, чтобы определить частоту мутаций в разных поколениях.

Перенесите одну колонию E. coli TOP10, содержащую векторы pBAD-ε и pGOOD1-εD12A11, в один миллилитр LB-среды, обработанной антибиотика