Сочетание Magnetic сортировка материнские клетки и колебания испытаний для анализа геномной нестабильности Во время митотического клеточного старения в Saccharomyces CEREVISIAE

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы определить, изменяются ли частоты мутаций с увеличением репликативности. Возраст дрожжевых клеток обусловлен просто дополнительными раундами деления клеток или возрастными изменениями в скорости накопления мутаций. Это достигается путем предварительного измерения частоты и скорости мутаций в молодых клетках путем распределения клеток на селективные и неселективные среды для расчета прогнозируемой частоты мутаций для клеток возрастающего возраста из-за накопления мутаций с каждым раундом деления клеток.

Затем популяцию дрожжевых клеток мечут биотином, выращенным в жидкой культуре, а исходные меченые клетки восстанавливают магнитной сортировкой для получения состаренных материнских клеток, которые претерпели несколько делений клеток. Затем стареющие материнские клетки либо выращивают заново для увеличения их возраста, а затем снова сортируют или окрашивают на предмет рубцов на ягодицах, а затем распределяют на селективные и неселективные среды для определения их среднего репликативного возраста, и получены результаты, которые показывают, есть ли какие-либо возрастные увеличения или уменьшения накапливающихся мутаций, основанные на сравнении экспериментально наблюдаемой частоты мутаций с прогнозируемой частотой мутаций для клеток Наблюдаемый средний возраст. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области старения, такие как способствуют ли изменения в скорости накопления генетических повреждений нормальному старению, или же различные генетические факторы и факторы окружающей среды влияют на продолжительность жизни, отчасти из-за изменений в частоте мутаций.

Эту процедуру будет демонстрировать Мелисса Паттерсон, аспирантка моей лаборатории, чтобы установить базовую частоту мутаций на поколение клеток с использованием флуктуационных тестов для клеток, выращенных в стандартных условиях культивирования. Для каждой репликируемой культуры разбавляют клетки от 1 до 2000 и распределяют от одного до четырех микролитров на неселективную среду для определения колониеобразующих единиц на миллилитр. Гранулируйте оставшиеся клетки при давлении 2400 G в течение одной минуты в микроцентрифуге и используйте 100 микролитров воды для их ресуспендирования перед распределением по селективной среде для идентификации мутантов.

После инкубации планшетов при 30 градусах Цельсия в течение трех дней подсчитайте колонии, определите начальную скорость и частоту мутаций в соответствии с прилагаемым текстовым протоколом для маркировки charmy CCI биотином. Начните с полос культуры из запасов глицерина на среду YPD и инкубируйте при 30 градусах Цельсия в течение одного-трех дней. С помощью стерильного наконечника пипетки перенесите клетки из тарелки хотя бы в один миллилитр воды. Имея в виду, что от одного до полутора сантиметров густо разросшейся части полосы даст примерно от 10 до восьми клеток.

Используйте гемоцитометр для определения точной плотности клеток для каждого штамма или условия лечения. Используйте запас реагентов с пятью миллимолярами биотина для маркировки от 10 до восьми клеток на точку сбора в соответствии со стандартной процедурой производителя. Выполняйте все этапы центрифугирования в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия после окончательной промывки.

Используйте воду для суспензии меченых клеток до конечной концентрации от 10 до 8 клеток на миллилитр, чтобы проверить жизнеспособность клеток, разбавьте 10 микролитров клеток 23 микролитрами воды и 67 микролитрами 0,4% триамного синего в одном XPBS инкубируйте клетки в течение 40 минут при комнатной температуре, прежде чем использовать гемоцитометр для оценки живых или неокрашенных и мертвых или окрашенных клеток. После измерения исходных значений клеточного возраста и частоты мутаций, в соответствии с текстовым протоколом, перенесите меченные биотином клетки в 20 миллилитров среды YPD. Претендуйте на восемь ячеек.

Выращивайте культуры в течение 16-18 часов при температуре от 20 градусов Цельсия до примерно 10-восьми клеток на миллилитр. Не позволяйте клеткам переходить в неподвижную фазу и при необходимости держите клетки при температуре четыре градуса Цельсия в течение нескольких часов, чтобы оптимизировать сроки периода роста и сбора. После определения плотности клеток и гранулирования клеток при четырех градусах Цельсия промойте клетки, добавив 30 миллилитров гранул для мечения, буфера и вортексинга, затем закрутите суспензию и слейте надосадочную жидкость.

После повторной промывки мы суспензируем ячейки в 50 микролитрах буфера для мечения. Представьте себе восемь всего клеток с помощью вортекса. Добавьте два микролитра магнитных шариков, доведите до восьми всего ячеек и после вортекса кратковременно инкубируйте на льду в течение 10 минут, периодически инвертируя.

Далее используйте 30 миллилитров буфера для маркировки шариков, чтобы трижды промыть ячейки. Затем добавьте 0,5 миллилитра буфера для маркировки шариков. Представьте себе восемь всего ячеек и кратковременно переведите гранулу на среднюю настройку до тех пор, пока ячейки не будут ресуспендированы.

Вылейте суспензию через клеточное сетчатое фильтр 40 микрон в пробирку объемом 50 миллилитров, чтобы удалить оставшиеся клеточные комки. При необходимости оставьте ячейки на льду на один-два часа до загрузки на колонку. Следуйте рекомендованному производителем протоколу для магнитных колонок, используя до двух умножить на 10 до девяти элементов.

Позаботьтесь о том, чтобы удалить все вентиляционные отверстия при загрузке колонн, а также снимите и замените колонну на сепараторе между промывками, чтобы ячейки не застряли между шариками. При использовании многоколоночных сепараторов для обработки нескольких колонок с одним и тем же образцом нанесите их все в одну сборную пробирку, чтобы сократить время обработки и уменьшить потери ячеек, если это необходимо. Сохраните поток, проходящий через этапы связывания и промывки, чтобы проанализировать молодые клетки, произведенные материнскими клетками, после концентрирования клеток путем центрифугирования при 3000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, аспирируйте все, кроме одного миллилитра буфера.

Представьте себе восемь исходных клеток, меченных биотином. Затем в вихре кратковременно приостановите клетки в оставшемся буфере. Используйте триам синий, чтобы окрашивать аликвоту разбавленных клеток, и используйте гемоцитометр для определения плотности и жизнеспособности клеток.

Затем подсчитайте общее количество восстановленных клеток. Если количество клеток значительно выше, чем ожидалось, пропустите образец элюирования через другую колонку, чтобы попытаться удалить загрязняющие молодые клетки. Если количество ячеек значительно меньше, чем ожидалось, пропустите сохраненный поток.

При желании просмотрите другую колонку, чтобы попытаться улучшить выход материнских клеток. Повторно выращивайте клетки для увеличения репликативного возраста и следуйте маркировке и сортировке гранул без мечения биотином. Чтобы определить репликативный возраст, перенесите 25 микролитров восстановленных клеток в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и используйте один миллилитр одного XPBS для двукратной промывки клеток, чтобы пометить рубцы от почек на поверхности клеток.

Используйте 180 микролитров одного XPBS и 20 микролитров флуоресцентно конъюгированного WGA для ресуспендирования клеток, накройте 1,5-миллилитровую центрифужную пробирку фольгой и инкубируйте с легким покачиванием при температуре 30 градусов Цельсия в течение 30 минут после инкубации. Используйте одну XPBS для трех мытья клеток. Затем для флуоресцентной микроскопии используйте реагент Antifa, чтобы закрепить клетки на предметных стеклах, чтобы избежать движения клеток во время визуализации.

Полностью высушите горки в темноте на срок до нескольких дней. Подсчитайте рубцы почек не менее чем на 50 клетках в образце, чтобы получить репрезентативное измерение клеточного возраста. В качестве альтернативы, после суспендирования клеток в одном XPBS проводят проточную цитометрию с использованием настроек, изложенных в текстовом протоколе графика рубцов от почек на молодых клетках и возрастных клеток, подсчитываемых с помощью микроскопии по оси Y против нормализованного геометрического флуоресценции сопряженного WGA флуоресценции из тех же клеточных популяций по оси x.

Наконец, получите уравнение линейной линии тренда для этой соотношения Для последующей подстановки нормализованное среднее геометрическое WGA сопряженной интенсивности флуоресценции клеточной популяции для X в уравнении и решите для Y, чтобы определить средний возраст клетки образца. Этот график показывает, что частота мутаций в гене can one была одинаковой до и после мечения биотином В независимых молодых популяциях дрожжей частота мутаций также была одинаковой в молодых клетках до и после мечения биотином при выращивании при температуре 20 или 30 градусов Цельсия. Показанный здесь график демонстрирует, что можно наблюдать при подсчете восстановленных клеток после мечения биотином и сортировке необработанных клеток или клеток, обработанных одной миллимолярной перекисью водорода после первой сортировки.

После первой сортировки количество клеток может оказаться выше, чем ожидалось, и при продолжении сортировки ожидается небольшая прогрессирующая потеря клеток. Репликативный возраст определяли путем ручного подсчета флуоресцентно меченных, но рубцов на клетках, как показано здесь, как видно на этом рисунке. Флуоресцентный, но рубцовый сигнал от проточной цитометрии сравнивали с ручным подсчетом для получения линейной зависимости, которая позволяет определить репликативный возраст материнских и контрольных клеточных популяций с помощью проточной цитометрии.

На этих графиках показаны примеры аналогичных или повышенных наблюдаемых частот мутаций старых материнских клеток по сравнению с прогнозируемыми частотами, рассчитанными на основе среднего возраста материнских клеток, а также частот и скоростей мутаций, полученных для молодых клеточных популяций. В зависимости от геномного расположения может быть один ген после этой процедуры. Другие методы могут быть использованы, такие как окрашивание на активные формы кислорода или морфология зубов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие изменения в физиологии клетки связаны с возрастными изменениями в накоплении мутаций.