Оценка проницаемости клеточного слоя при нереплицирующем персистентном Mycobacterium tuberculosis

Начните с трубок, содержащих нереплицирующуюся персистентную, или NRP-стадию Mycobacterium tuberculosis, которая имеет утолщённый внешний слой.

Добавьте стеклянные шарики в одну трубку и встряхните, чтобы механически разрушить внешний слой микобактерии и повысить проницаемость.

Далее перенесите микобактериальную суспензию, выбитую в бусинке, в свежую трубку.

Добавьте флуоресцентно маркированный рифампицин — противотуберкулёзный антибиотик — как к необработанным, так и в суспензии клеточных суспензий.

Инкубировать с помощью встряхивания, чтобы флуоресцентно меченный рифампицин попал в микоббактерии.

Со временем в микобактерии поступает всё больше рифампицина.

Центрифугуйте образцы, чтобы разделить клетки и удалить супернатант, содержащий несвязанный рифампицин.

Суспензировать микобактерии в свежей среде.

Проанализируйте образцы с помощью проточной цитометрии. Когда клетки проходят через лазерный луч, они излучают флуоресценцию, пропорциональную внутриклеточному флуоресцентному рифампицину.

В разные временные моменты необработанные клетки NRP показывают более низкую флуоресцентность, чем клетки с использованием бусин.

Это указывает на то, что утолщённый внешний слой ограничивает вход рифампицина, поддерживая устойчивость бактерий во время взаимодействия хозяина и патогена.