Визуализация распределения бактериального белка в трёх измерениях с помощью флуоресцентной визуализации

Начните с герметичного стекла с бактериальными клетками, маркированными цитоплазматическим красным флуоресцентным маркером и белок-специфическим зелёным флуоресцентным маркером.

Осмотрите слайд под флуоресцентным микроскопом.

Определите поле с хорошо изолированными бактериальными клетками и сосредоточьтесь на центре представительной клетки.

Установите первый флуоресцентный канал и получите z-стековое изображение с определёнными параметрами, чтобы запечатлеть трёхмерную форму представительной ячейки и её близлежащих клеток.

Затем переключитесь на второй флуоресцентный канал и получите другое z-стековое изображение тех же ячеек с теми же параметрами.

Он захватывает распределение бактериальных белков внутри клеток.

Вырезать отдельные клетки из каждого z-стека для их выделения для анализа по одной ячейке.

Выровняйте эти изображения, чтобы визуализировать распределение бактериальных белков относительно формы клетки, что позволяет проводить точный анализ во время взаимодействия хозяина и патогена.

Сразу после герметизации крышки поставьте затвор на ступень микроскопа, а после пяти минут термического равновесия используйте фокусные колёса микроскопа, чтобы привести центр клетки в фокус. В соответствующем микроскопическом программном обеспечении в разделе ND Acquisition поставьте галочку Z, чтобы получить стек Z, и нажмите кнопку «Домой», чтобы установить середину ячейки в качестве отправной точки. Установите размер шага на 0,1 микрометра, а диапазон — на четыре микрометра, и убедитесь, что устройство Z установлено на пьезо-ступень.

Крайне важно, чтобы на верхней и нижней части клетки было достаточно размытия, чтобы клетка была почти неотличима от фона. Установите флуоресцентные каналы под лямбда-окном на параметры для флуоресцентных молекул для изображения и убедитесь, что порядок эксперимента установлен на лямбда, чтобы получить полный Z-стек в каждом цветном канале перед переключением. Затем нажмите «Запустить сейчас», чтобы начать сбор изображений.

Когда все изображения будут собраны, откройте файлы в соответствующем программном обеспечении для анализа изображений. Нарисуйте поле вокруг отдельной ячейки и дублируете её два раза, по одному разу для каждого канала, убедившись, что галочка Duplicate hyperstack выполнена, и измените канал на один или два. Когда оба стека станут доступны, выберите Images, Stacks, Tools и Concatenate для объединения изображений.