Использование потоков для слива воды и вращающихся дисков для реакторов Золотистый стафилококк Биопленка Анализ

Общая цель этой процедуры заключается в выращивании бактериальных биопленок при низкой или умеренной силе с использованием либо капельного биопленочного реактора, либо реактора с вращающимся диском. Купоны в биопленке вступают в реакцию, так как сначала инокулируются бактериями и инкубируются при 37 градусах Цельсия, чтобы позволить бактериальным клеткам прилипнуть к поверхностям роста. Как только клетки прикрепляются к купонам, поток питательной среды начинает производить чистую силу, которая действует во время развития биопленки.

Затем можно собрать зрелые биопленки для анализа, наблюдения за биопленками. С помощью сканирующей электронной микроскопии можно провести определение ультраструктуры полученных биопленок. Я Blaze Balls.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как проточные ячейки, заключается в том, что можно легко получить высокую биомассу и несколько идентичных биопленок. Демонстрировать эту процедуру будут Рэйчел Стивенсон и Келли Шварц, техник и аспирант из моей лаборатории. Биопленочный реактор с капельным потоком состоит из четырех камер с входными отверстиями для входа среды и выходными отверстиями для выхода отходов.

Внутри каждой камеры находится съемный купон, на котором растет биопленка. Чтобы собрать биопленочный реактор с капельным потоком, поместите купоны в каждую параллельную камеру и закройте крышки камер. Автоклавируйте собранный реактор, а также трубки с текучими питательными веществами для стерилизации системы перед использованием.

Также автоклавируйте биопленочную среду для выращивания для инокуляции стерилизованного реактора капельного потока. Поместите аппарат на ровную поверхность и зажмите линии сточных вод. Далее заполните каждую камеру 10 миллилитрами стерильной питательной среды на основе соевого бульона триптиха, и добавьте 100 микролитров золотистого стафилококка.

На ночь культуру выращивают в одной и той же среде к каждой камере отдельно. Поместите инокулированный реактор в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 18 часов, чтобы клетки прилипли к поверхности купона. После инкубации UNC зажимает трубки для сточных вод и помещает реактор на наклонный деревянный резак под углом 10 градусов. Асептически.

Подсоедините трубку с текучими питательными веществами к бутылке с непрерывным потоком питательного бульона. Проложите трубопровод через насос и заправьте трубки, запустив насос на полной скорости. После того, как текучая трубка будет заполнена, остановите насос и прикрепите иглы 22 калибра в один дюйм к концу каждой трубки.

Протрите пробку входного отверстия камеры этаноловой салфеткой и протрите ее асептическим способом. Вставьте иглы через входную пробку. Включите насос и дайте среде капнуть на купоны.

При скорости потока примерно 125 микролитров в минуту среда должна течь вниз от входного отверстия пробки к отверстному отверстию. Эксплуатация реактора в непрерывном потоке в течение трех суток. Время от времени проверяем реактор на исправность дренажа.

Дренаж проверяется путем визуального осмотра камер, чтобы убедиться, что среда не скапливается в камерах. Если среда скапливается, защемляется, отводящая трубка обычно способствует надлежащему дренажу для сбора биопленок, остановки насоса и извлечения игл из реактора. Затем поставьте реактор на ровную поверхность.

После трех дней непрерывного течения биопленки золотистого стафилококка проявляются в виде желтой биомассы, распределенной по длине привитых купонов. Сканирующая электронная микрофотография биопленки выявляет золотистый стафилококк, покрывающий купон в поверхностно-ассоциированном биопленочном сообществе. Чтобы количественно оценить полученную биомассу, используйте стерильные щипцы для септического удаления, удаления купонов, сбора бактерий с помощью скребка для клеток, а затем переноса их в коническую пробирку, содержащую пять миллилитров стерильного PBS.

С помощью ткани гомогенизатор дезагрегирует бактериальные комки до получения однородной суспензии. Колониеобразующие единицы количественно оцениваются путем нанесения серийных разведений на триптиховые согарные пластины, инкубируются в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и подсчитывают колонии. Биопленочный реактор с вращающимся диском состоит из хемосстата, через который прокачивается питательная среда.

Спиннинговый диск со звездочкой и 18 купонами, предназначенными для установки в спиннинговый диск. Чтобы сначала собрать реактор, загрузите купоны вращающегося диска в прорези вращающегося диска. Затем поместите загруженный диск внутрь литрового стеклянного стакана с переливным отверстием и закройте реактор резиновой пробкой No 15 с одним отверстием для потока среды и одним отверстием для аэрации.

Автоклав, собранный реактор и входная трубка для стерилизации системы. Чтобы инокулировать реактор, заполните стакан 250 миллилитрами стерильной питательной среды и добавьте 500 микролитров ночной культуры золотистого стафилококка, выращенной в триптиховом соевом бульоне. Поместите реактор на перемешивающую пластину, установленную на 250 оборотов в минуту, и инкубируйте его в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы клетки могли прилипнуть к купонам.

После ночной инкубации подсоедините входную трубку к порту на резервуаре для среды и к перистальтическому насосу. Включите насос и установите расход на 0,25 миллилитра в минуту. Дайте реактору поработать в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы собрать полученные биопленки.

Остановите реактор и асептично. Снимите диск, не прикасаясь к талонам. С помощью стерильных щипцов извлеките купоны и осторожно окуните каждый из них в стерильный PBS, чтобы удалить слабо прикрепленные бактерии для тестирования антимикробных соединений.

Асептически поместите купоны в отдельные лунки 96-луночной пластины, содержащие интересующие соединения. Выдерживайте тарелку в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем переложите купоны в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра, содержащие один PBS, и диспергируйте биопленки с помощью гомогенизатора.

Наконец, пластинчатые серийные разведения клеток на питательной агаровой среде для определения количества жизнеспособных колониеобразующих единиц в образце, как описано ранее. На этом графике показано количество колониеобразующих единиц в биопленках, приготовленных с помощью реактора с вращающимся диском и подвергшихся воздействию перекиси водорода, способность производить до 18 идентичных биопленок. Использование вращающегося дискового реактора делает этот метод идеальным для тестирования антимикробных соединений.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как запускать биопленки капельного потока и вращающегося диска реактора. Эти биопленочные реакторы представляют собой альтернативу проточным ячейкам и микротитровочным пластинчатым биопленкам и идеально подходят для тех случаев, когда требуется большое количество биопленки или требуется антимикробное тестирование установленных биопленок.