Мониторинг динамических изменений в митохондриальной уровня кальция во время апоптоза Использование генетически закодированные Кальций датчика

Общая цель этой процедуры заключается в мониторинге изменений концентрации кальция в митохондриях в живых клетках. Это достигается путем первого пересечения клеток с помощью метрики соотношения белков индикатора кальция peram, который нацелен на митохондриальный матрикс, через один или два дня после трансфекции. Флуоресцентный микроскоп и программное обеспечение настроены на визуализацию живых клеток.

Изображения метрических клеток, экспрессирующих перам, затем получают после добавления агониста, мобилизующего кальций. Завершающим этапом процедуры является количественный анализ полученных изображений. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают динамические изменения концентрации кальция в митохондриях с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток, экспрессирующих метрическое соотношение белка-индикатора кальция.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как измерение уровня кальция с помощью синтетических индикаторов кальция, заключается в том, что метрический перам является генетически закодированным и, таким образом, может быть нацелен на митохондрии или любой другой орган, представляющий интерес. Здравствуйте, я доктор Аскар, постдок в лаборатории доктора Беннинга, и я продемонстрирую процедуру сегодня. Чтобы начать протокольную пластину для хелоклеток накануне вечером, трансфекцию на стерильную стеклянную крышку помещают в стандартный шестилуночный планшет для культуры с плотностью, которая будет составлять примерно 70% для трансфекции на следующий день. На следующий день готовят комплексы DNA Lipectomy 2000 в соответствии с инструкцией производителя с четырьмя микрограммами метрического вектора митохондриальной экспрессии перам и 10 микролитрами Lipectomy 2000, разведенными в 0,5 миллилитрах оптимальной для каждой трансфицируемой лунки.

Затем замените питательные среды D-M-E-M-F-B-S HELOC в каждой лунке на 1,5 миллилитра той же среды без антибиотиков. Добавьте раствор ЛИПЭКТОМИЯ в раствор ДНК и аккуратно перемешайте после образования комплексов. Добавьте раствор липэктомии ДНК по каплям в каждую лунку, которую нужно перемешать, осторожно покачивая планшет, и инкубировать в течение четырех часов в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа после инкубации.

Замените среду на D-M-E-M-F-B-S, содержащую антибиотики. Дайте клеткам сцеживаться в метрической системе в течение одного-двух дней перед визуализацией с помощью щипцов. Аккуратно поместите крышку с ячейками HELOC в подходящую камеру для визуализации с раствором для визуализации.

Установите камеру визуализации в предметный столик с перевернутым микроскопом. Затем используйте масляный иммерсионный объектив 40x или выше и длину волны 380 нанометров. Чтобы найти область интереса, содержащую одну или несколько ячеек, выражающих метрическое отношение peram 380 нанометров, используется здесь для идентификации ячеек как метрики отношения.

Перам менее устойчив к фотообесцвечиванию на этой длине волны. После того, как область интереса определена, настройте программное обеспечение для двойного возбуждения на 495 и 380 нанометрах. Затем получайте изображения последовательно, попеременно возбуждая на 495 и 380 нанометрах.

Получите изображения исходного уровня кальция в течение не менее 30 секунд перед применением агониста. Затем нанесите агонист, мобилизующий кальций, с помощью аппарата для обильного использования, отмечая, что время добавления для каждого агониста и интервалы получения должны быть оптимизированы, чтобы предотвратить фотообесцвечивание, сохраняя при этом достаточное временное разрешение. После завершения эксперимента изображения можно анализировать в автономном режиме.

Чтобы начать анализ, выберите интересующую область в пустой области поля, чтобы при необходимости вычесть фоновую флуоресценцию. Затем экспортируйте измерения соотношения 4 95 3 80 из интересующей области в Excel или аналогичное программное обеспечение для построения графиков. На этой панели изображений показана субклеточная локализация метрического соотношения перам и митохондрий.

Слева представлено изображение живых клеток helo клеток, выражающих метрическое отношение peram. В центре происходит флуоресцентное окрашивание митохондрий и селективный краситель MIT трекер красного CMX Ross. И, наконец, справа, показанное здесь объединенное изображение, представляет собой серию псевдоцветных изображений 4 95, 3 80 нанометров четырех хелоклеток, экспрессирующих метрический перам в митохондриях, обработанных 10 микромолярными А TP, и количественная оценка изменений уровней кальция в митохондриях этих предыдущих четырех клеток показана здесь на этом изображении метрического коэффициента экспрессии клеток хела в митохондриях.

Гетерогенность кальциевого ответа в отдельных митохондриях, а также значительная фрагментация митохондрий проявляются при 60-минутном воздействии спорина 0,5 микромоля. Некоторые митохондрии имеют колебательное увеличение кальция, показанное белой стрелкой, в то время как другие не показывают значительных изменений уровня кальция, показанных желтой стрелкой. Этот график показывает изменение глобальных уровней кальция в митохондриях в одной хелоклетке после индукции апоптоза в течение 120 минут с 0,5 микромолярного спорина.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как измерить динамические изменения уровня кальция в митохондриях в ответ на различные tli с помощью геометрического перама с кальциевым препаратом белка R, который избирательно нацелен на митохондриальный матрикс.