Митохондриальной Ca^{2 +} сохранение потенциала пробирного и Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной отек Assay

Этот протокол направлен для описания метода для изучения Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала и Ca^{2 +}- срабатывает митохондриальной отек изолированных митохондриях SH-SY5Y клеток, шаг за шагом.

Общая цель этого эксперимента — определить способность митохондрий удерживать кальций при набухании митохондрий, вызванном кальцием. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении митохондриальной дисфункции, такие как аномальный энергетический обмен. Главное преимущество этой методики в том, что она очень проста и эффективна.

Для начала посейте около трех миллионов клеток SH-SY5Y на 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток. Удалите среду и промойте клетки примерно одним миллилитром ледяного PBS в 10-сантиметровой чашке для клеточных культур три раза. Добавьте один миллилитр ледяного PBS в 10-сантиметровую чашку для клеточных культур и соскребите адгезивные клетки в новую 1,5-миллилитровую пробирку.

Центрифугируйте при 800 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Во время центрифугирования приготовьте пять миллилитров митохондриального изоляционного буфера, дополненного 50 микролитрами стокового раствора ингибитора протеазы. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу с одним миллилитром митохондриального изоляционного буфера.

Инкубируйте 1,5-миллилитровую трубку на льду в течение 30 минут. Затем лизируйте взвешенные клетки с помощью стеклянного гомогенизатора, вверх и вниз вручную по льду. Перелейте гомогенат в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Затем центрифугируйте при температуре 1000 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить мусор. После центрифугирования переложите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра, прежде чем снова центрифугировать, как и раньше. После переноса надосадочной жидкости в новую пробирку центрифугируйте при 14 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу, содержащую митохондрии, с одним миллилитром митохондриального изоляционного буфера. Затем центрифугируйте раствор в течение 15 минут при температуре 14 000 G и четырех градусах Цельсия, чтобы осаждать митохондрии. Полученную митохондриальную гранулу необходимо держать на льду и повторно суспендировать в 50-100 микролитрах хлоридной среды калия, в зависимости от объема гранулы, перед любым анализом.

Наконец, используйте пять микролитров митохондриального раствора для измерения концентрации митохондриального белка с помощью стандартного анализа BCA, измеряя OD562 с помощью планшетного ридера. Перед началом эксперимента приготовьте среду на основе хлорида калия и добавьте зеленый флуоресцентный краситель, связывающий кальций, до конечной концентрации 0,5 микромоля. Чтобы определить способность митохондрий удерживать кальций, сначала перенесите один миллилитр изолированных митохондрий в среде хлорида калия, содержащей 0,5 микромолярного зеленого флуоресцентного красителя, связывающего кальций, в каждую лунку шестилуночного планшета.

Инкубируйте митохондрии и связывающий кальций зеленый флуоресцентный краситель в шестилуночном планшете при комнатной температуре, защищенной от окружающего света в течение одной минуты. После инкубации добавьте четыре микролитра аликвот в 20 миллимолярном растворе хлорида кальция в каждую лунку шестилуночного планшета, используя автоматическую настройку дозирования, чтобы ввести 200 наномолей кальция на миллиграмм митохондриального белка. Используйте флуоресцентный спектрометр для мониторинга изменений флуоресценции каждые три секунды в течение двух минут с длиной волны возбуждения 506 нанометров и длиной волны излучения 531 нанометр.

Пластина оснащена встряхиванием при 600 об/мин в течение трех секунд между показаниями, управляемым программным обеспечением. Добавьте в каждую лунку дополнительно четыре микролитра аликвоты 20 миллимолярного раствора хлорида кальция, затем следите за изменениями флуоресценции каждые три секунды в течение двух минут. Чтобы определить вызванный кальцием митохондриальный набухание, перенесите один миллилитр изолированных митохондрий в среде хлорида калия в каждую лунку шестилуночного планшета.

Затем добавьте 10 микролитров 20 миллимолярного водного раствора хлорида кальция к митохондриальному белку, чтобы вызвать отек митохондрий. С помощью микропланшетного ридера, управляемого программным обеспечением, записывайте снижение поглощения каждые три секунды в течение 10 минут при 540 нанометрах. Здесь представлены репрезентативные результаты митохондриального удержания кальция бонгкрекичем, ингибитора кальциево-индуцированной переходной поры митохондриальной проницаемости, или MPTP, открывающего атрактилозид, активатора кальциев-индуцированного открытия MPTP и холостого контроля.

Как и ожидалось, емкость при лечении бонгкрекичем намного выше, чем у группы атрактилозидов. Здесь представлены репрезентативные результаты кальциевого индуцированного митохондриального отека бонгкрекича, атрактилозида и отсутствия лечения в контроле. Снижение поглощения, наблюдаемое на уровне 540 нанометров, указывает на митохондриальные отеки.

Результаты показывают, что BKA может препятствовать открытию MPTP, в то время как ATR может способствовать открытию MPTP. После освоения этой техники ее можно выполнить за пять часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что все растворы должны быть заморожены.