Обнаружение митохондрий мембранного потенциала для изучения CLIC4 сногсшибательно индуцированной HN4 клеток апоптоз в пробирке

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в цитобиологической области, включая понимание апоптоза и дисфункции митохондрий. Основное преимущество этой методики заключается в том, что исследователи могут легко и правильно проводить мониторинг потенциала мембраны митохондрий в режиме реального времени с помощью родамина-123 в пределах одной клетки. Культивируйте клеточную линию HN4 из плоскоклеточной карциномы головы и шеи, как описано в текстовом протоколе.

За сутки до трансфекции в планшет помещают 0,5 млн клеток в два миллилитра на лунку питательной среды без антибиотиков в шестилуночные планшеты. Осторожно разведите 100 пикомолев малой интерферирующей РНК CLIC4 или скремблированной малой интерферирующей РНК в 250 микролитрах восстановленной сывороточной среды. Затем разведите пять микролитров липосомального реагента в 250 микролитрах восстановленной сывороточной среды и инкубируйте в течение пяти минут.

Соедините разведенную мелкую интерферирующую РНК с разведенным реагентом из липосомы и аккуратно перемешайте. Добавьте смесь в каждую лунку, содержащую клетки в среде. Аккуратно перемешивайте, покачивая тарелку вперед и назад.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в CO2-инкубаторе. Замените среду на обычную питательную среду через четыре часа после трансфекции. Продолжайте инкубацию клеток в течение еще 20 часов, прежде чем приступить к процедуре мечения родамином-123.

После обработки клеток HN4 с помощью малой интерферирующей РНК CLIC4 в шестилуночных планшетах с помощью пинцета на дно новых 12-луночных планшетов наклеиваются круглые покровные стекла. Пипетка 150 микролитров 100 микрограмм на миллилитр полилизина на середину каждого покровного стекла внутри 12-луночных планшетов. Через две минуты тщательно удалите полилизин пипеткой.

Затем извлеките питательную среду из клеток HN4 внутрь чашки и добавьте один миллилитр 0,25% трипсина, чтобы отделить клетки. Через шесть минут добавьте два миллилитра питательной среды для нейтрализации трипсина. Аккуратно перемешайте клетки HN4 с помощью пипетки пять раз и засейте клетки на круглые покровные стекла.

Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. После восьми часов инкубации добавьте два микромоля на литр родамина-123 и осторожно перемешайте среду вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение в среде. Инкубируйте клетки HN4 в течение 40 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

С помощью пинцета снимите покровные стекла и кратковременно перенесите их в предварительно нагретый буфер NPSS, чтобы смыть остатки жидкости. Поместите покровные стекла на дно камеры из нержавеющей стали объемом 500 микролитров со сменным стеклянным дном 25 миллиметров, запечатанным на месте уплотнительным кольцом. Закрепите покровные стекла на месте, закрутив крышку камеры.

Добавьте в собранную камеру 450 микролитров предварительно нагретого буфера NPSS. Затем поместите ванну под поле зрения флуоресцентного микроскопа или конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа. Включите флуоресцентный микроскоп, следуя инструкциям производителя.

Откройте программное обеспечение системы обработки изображений и нажмите новую кнопку на панели команд, чтобы начать новый эксперимент. Отрегулируйте поле зрения и сфокусируйтесь, чтобы найти расположение клеток в белом свете. Затем выключите свет и нажмите кнопку, чтобы закрыть белый свет.

Нажмите кнопку фокусировки на панели команд и выберите «Начать фокусировку», чтобы включить флуоресценцию. Снова найдите расположение ячеек с помощью микроскопа с возбуждением 507 нм и длиной волны длинного излучения 529 нм. Отрегулируйте поле зрения и при необходимости снова сфокусируйтесь.

Выберите поле зрения, содержащее всего от 20 до 30 разделенных ячеек HN4. Как только поле зрения станет четким, нажмите кнопку «Закрыть фокусировку» на панели фокусировки. Затем нажмите кнопку «Получить» на панели команд, чтобы получить один набор изображений.

Затем щелкните области на панели команд и нажмите кнопку OK, чтобы отредактировать области измерения. Чтобы подогнать отдельные ячейки разной формы, выберите инструмент «Область трассировки». Обведите область одной одиночной клетки и дважды кликните, когда закончите.

Повторяйте процедуру до тех пор, пока все ячейки не будут обведены. Нажмите «Готово» и выберите «Сохранить изображения», чтобы найти сохраненное местоположение. Нажмите нулевой час и быстро нажмите F4, чтобы начать мониторинг изменения интенсивности флуоресценции.

Записывайте изменение интенсивности флуоресценции в режиме реального времени один раз в пять секунд в течение пяти минут. Когда исходный уровень станет стабильным, добавьте в камеру через пипеттер 50 микролитров НПСС, смешанных с 0,5 микролитрами 100 ммоль на литр АТФ. Включите конфокальный лазерный сканирующий флуоресцентный микроскоп, следуя инструкциям производителя, и откройте прилагаемое программное обеспечение.

Нажмите «Объектив» в меню захвата, чтобы выбрать объектив с масляной апертурой 63X 1,4. Понаблюдайте за образцом и найдите четкое поле зрения под световым полем. Нажмите кнопку выбора света, чтобы переключиться в режим флуоресценции, и выберите правильные флуоресцентные фильтры, чтобы определить местоположение клетки в темноте с помощью микроскопа.

Нажмите затвор, чтобы защитить образец после завершения наблюдения. В меню захвата настройте подходящий канал ФЭУ и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы активировать установленный оптический тракт. Нажмите на меню конфигурации и выберите лазер, чтобы определить необходимый тип лазера.

Щелкните в реальном времени, чтобы получить изображения в режиме реального времени, и убедитесь, что поле зрения содержит только от 20 до 30 отделенных ячеек HN4. Затем выберите XYT в режиме сбора данных в подменю сбора данных в меню сбора. Установите пять секунд для временного интервала и 20 минут для продолжительности.

Нажмите кнопку «Применить», когда все параметры будут рассчитаны. В меню количественной оценки с помощью инструмента «Нарисовать полилинию» обведите область записи каждой ячейки. Выберите профиль линии и выберите начало ведения наблюдения.

Записывайте изменение интенсивности флуоресценции в режиме реального времени в течение пяти минут. Когда исходный уровень станет стабильным, добавьте в камеру 50 микролитров NPSS, смешанных с 0,5 микролитрами 100 ммоль на литр АТФ, с помощью дозатора. Чтобы выполнить статистический анализ с помощью обычного флуоресцентного микроскопа, откройте программное обеспечение системы визуализации и нажмите кнопку «Открыть» на панели команд, чтобы открыть сохраненный эксперимент.

Щелкните области на панели команд и нажмите кнопку OK, чтобы отредактировать области измерения. Выберите инструмент для создания области трассировки. Обведите область одной отдельной ячейки и дважды кликните, когда закончите.

Повторяйте процедуру до тех пор, пока все ячейки не будут обведены. Нажмите кнопку «Готово» и нажмите кнопку «Вперед» F4, чтобы получить кривую, показывающую интенсивность флуоресценции. По завершении нажмите кнопку со стрелкой вниз, расположенную в правом нижнем углу графика, и нажмите «Показать данные графика».

Дважды нажмите OK и нажмите кнопку log data, чтобы открыть интерфейс программного обеспечения для обработки данных. Затем нажмите «Данные журнала» еще раз, чтобы найти записи о колебаниях интенсивности флуоресценции в режиме реального времени, которые отображаются в электронной таблице. Здесь представлены репрезентативные результаты, показывающие индуцированные АТФ изменения митохондриальной деполяризации в клетке HN4 при различных вмешательствах, разрешенных с помощью обычной флуоресцентной микроскопии.

Деполяризация митохондриальной мембраны быстро увеличивалась после лечения АТФ и постепенно восстанавливалась до нормального уровня в обеих группах. Репрезентативные следы интенсивности флуоресценции родамина-123 демонстрируют обработку ММП малой интерферирующей РНК CLIC4, усиливающей деполяризацию митохондрий по сравнению с контрольной группой. Репрезентативная гистограмма также показала, что нокдаун CLIC4 усиливает деполяризацию митохондрий по сравнению с контрольной группой.

Здесь репрезентативные результаты конфокальной лазерной сканирующей микроскопии также показывают АТФ-индуцированные изменения митохондриальной деполяризации в клетке HN4 при различных вмешательствах. Деполяризация митохондриальной мембраны быстро увеличивается после лечения АТФ и постепенно восстанавливается до нормального уровня в обеих группах. Репрезентативные следы интенсивности флуоресценции родамина-123 показывают, что обработка ММП малой интерферирующей РНК CLIC4 усиливает деполяризацию митохондрий по сравнению с контрольной группой.

Аналогичным образом, репрезентативная гистограмма показала, что нокдаун CLIC4 усиливает деполяризацию митохондрий по сравнению с контрольной группой. После просмотра этого видео у вас будет лучшее понимание того, как использовать родамин-123 для проведения мониторинга потенциала митохондриальной мембраны в режиме реального времени как с помощью обычной флуоресцентной микроскопии, так и с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. После освоения эта техника микроскопии с родамином-123 может быть выполнена менее чем за 20 минут на одном образце, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что нельзя контактировать с камерой во время инъекции в ожидании процесса сканирования. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как вестерн-блот и проточная цитометрия, чтобы ответить на дальнейшие вопросы, например, произошел ли апоптоз или некроз. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области живой науки к изучению митохондриальной дисфункции и поиску убедительных доказательств клеточного апоптоза в различных живых клетках.

Не забывайте, что работа с родамином-123 может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и масок для лица.