Обнаружение посттрансляционной Изменения по земельному Неповрежденный нуклеосом с помощью ИФА

Общая цель этой процедуры заключается в точном определении относительных уровней посттрансляционных модификаций в препаратах общего количества клеточных нуклеосом, полученных из миллиона клеток. Это достигается путем предварительного приготовления высококачественных однородных культур клеток млекопитающих. Затем ядра выделяются из клеток путем механического разрушения с помощью дауна, гомогенизатора и центрифугирования.

Следующим шагом является получение интактных нуклеосом путем расщепления хроматина, присутствующего в ядрах, и выполнения серии гипотонических экстракций. Наконец, нуклеосомы опрашивают с помощью анализа ELIZA с соответствующим контролем для выявления специфических посттрансляционных модификаций. В конечном итоге могут быть получены результаты, показывающие относительные уровни специфических модификаций, присутствующих в образцах нуклеосом.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как вестерн-блоттинг и хроматиновая иммунопреципитация, заключается в том, что можно легко определить глобальную картину ряда состояний модификации нуклеосом. Этот метод гораздо более чувствителен и точен, чем вестерн-блоттинг, и может быть выполнен в большинстве лабораторий, оборудованных для экспериментов в области общей молекулярной биологии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области стволовых клеток и эпигенетики, например, что происходит, когда происходят основные события дифференцировки и перепрограммирования.

Чтобы начать процедуру, сначала трипы анизируют клетки тремя миллилитрами трипсина на 15-сантиметровую пластину до свежих трипов инизированных клеток. Добавьте 20 миллилитров ледяного бутирата PBS. Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте пробирку для сбора клеток при 1000 об/мин в течение пяти минут, аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте 10 миллилитров ледяного бутирата PBS для промывки, снова центрифугируйте клеточную суспензию при 1000 об/мин в течение пяти минут.

Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в четырех миллилитрах буфера для лизиса с ингибиторами протеазы, как описано в письменном протоколе. Далее пипеткой подайте клетки в гомогенизатор типа А типа В, на лед вниз гомогенизируйте за 20 ударов. Затем переложите гомогенат в центрифужную пробирку на льду.

Центрифугируйте образец при 2000 G в течение 10 минут. При четырех градусах по Цельсию. Удалите супер названный, который содержит цитоплазматический материал и резус.

Суспензируйте гранулу в двух миллилитрах ледяного буфера для стирки C С ингибиторами протеазы аккуратно наложите ресуспендированный материал на пятимиллилитровую подушку с 30% сахарозой в холодной центрифужной пробирке. Чтобы изолировать центрифугу с ядрами при давлении 2400 G в течение пяти минут в качающемся ведре, ядра ротора будут мигрировать через подушку, а клеточный мусор останется на границе раздела. После центрифугирования тщательно удалите весь объем жидкости и повторно суспендируйте ядра в 250 микролитрах ледяного промывочного буфера С с ингибиторами протеазы, перенесите ядра в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитров

Чтобы начать выделение нуклеосом, добавьте три микролитра 0,1 моляра хлорида кальция в ядра и поместите в термоблок с температурой 37 градусов Цельсия до тех пор, пока температура не уравновесится. Затем добавьте две единицы микрококальной нуклеазы в 10 микролитров микрококальной нуклеазы, буферизуйте и инкубируйте в течение 12 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Часто перемешивайте с помощью наконечника для дозатора.

После инкубации прекратите реакцию шестью микролитрами 0,5 моляра натрия E-D-T-A-P-H и поместите на лед для охлаждения. Затем центрифугируйте образец при 2000 G в течение четырех минут после центрифугирования, выбросьте снац и снова суспендируйте гранулу. В 300 микролитрах 0,2 миллимола или натрия ЭДТА инкубируйте образец на льду в течение одного часа, время от времени осторожно перемешивая его пипетированием.

После центрифугирования при 3000 G в течение четырех минут. При четырех градусах Цельсия соберите надосадочную жидкость, которая содержит свободные нуклеосомы, в новую пробирку Fuge и храните на льду намеренно дополнительные нуклеосомы reus. Суспензируйте гранулу в 300 микролитрах 0,2 миллимоля или натрия ЭДТ, как и раньше, и инкубируйте на льду в течение одного часа, время от времени осторожно перемешивая.

После инкубации центрифугируйте образец. Снова соедините полученный снат с оставшимся образцом в микрофуге-пробирке на льду. Для начала нуклеосомного анализа Элизы загрузите 96 луночный планшет Элизы с нисходящей серией из пяти двукратных серийных разведений нуклеосом и покрытия буфера, начиная с 0,1 мкг на 50 мкл в верхней лунке.

Не забывайте включать лунки с буфером покрытия только в качестве контрольных. На следующий день инкубируйте тарелку на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Используйте омыватель тарелок для мытья тарелок из расчета 200 микролитров на лунку 0,5% при температуре 20 в PBS при комнатной температуре четыре раза в общей сложности 10 минут.

Теперь добавьте 100 микролитров на лунку блокирующего раствора и инкубируйте в течение часа при комнатной температуре на ротаторе. После инкубации извлеките блокирующий буфер, энергично встряхнув перевернутую пластину над раковиной. Далее добавляют разведенное первичное антитело в объеме 50 мкл на лунку в раствор 5% ПСА в 0,05% от 20 до PBS, инкубируют раствор в течение одного часа на ротаторе при комнатной температуре.

После первичной инкубации антител вымойте планшеты так же, как и до использования машины для мытья тарелок. После завершения процедуры промывки добавьте 50 микролитров в лунку конъюгированного вторичного антитела к пероксидазе хрена, разведенного в PBS с 5% BS, A и 0,5%20 при комнатной температуре в течение одного часа на ротаторе после инкубации вторичных антител. Вымойте тарелки, как и раньше.

Использование шайбы для пластин для проявления пластины. Добавьте в каждую лунку по 50 микролитров субстрата TMB Eliza и выдерживайте 10 минут. При комнатной температуре лунки пластины ELIZA становятся синими, а интенсивность пропорциональна количеству нуклеосомных модификаций, присутствующих в каждой из них.

Ну тогда прекратите реакцию. Путем добавления 50 микролитров на лунку двух нормальных серных кислот. Цвет изменится на коричневый, центрифугируйте пластину при 1500 об/мин в течение двух минут, чтобы рассеять пузырьки воздуха.

Теперь номерной знак готов к количественной оценке на считывателе цветных метрических пластин. Наконец, считайте пластину на 450 нанометрах и экспортируйте результаты для анализа. После освоения этой техники ее можно сделать за два дня, если она будет выполнена правильно после ее освоения.

Этот метод открыл двери для исследователей в области исследований стволовых клеток для изучения эпигенетических реакций на события дифференцировки и перепрограммирования на уровне всего эпипротеома.