Анализ функций малого ГТФаз по микроинъекции Плазмиды в поляризованных эпителиальных клеток

Эта процедура позволяет оценить влияние малых АПФ ГТФ на транспорт поляризованных мембран. Во-первых, co вводит ДНК-плазмиды, кодирующие малый ГТФ ACE и репортерные белки, в ядра поляризованных клеток. Затем экспрессируйте ДНК при температурах, которые остановят репортерные белки в эндоплазматическом ретикулуме или TGN, в то время как малый GTPA накапливается в цитозоле, продолжайте преследовать репортерный белок к поверхности клетки в присутствии cyclo heide, чтобы предотвратить дальнейший синтез белка.

Наконец, пометьте репортерный белок на поверхности клетки для иммунофлуоресцентного анализа. Результаты, полученные в результате этого анализа, позволяют визуализировать изменение локализации поверхности с помощью конфокальной микроскопии. Основное преимущество этой методики по сравнению с существующими методами, такими как трансфект, заключается в том, что в течение короткого времени сверхэкспрессии, достигаемой с помощью микроинъекции, вторичные эффекты минимальны, что позволяет нам изучать первичные эффекты интересующих белков.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной полярности, например, как малый ГТФА регулирует трафик поляризованной мембраны. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как отдельные шаги, необходимые для успешной микроинъекции, трудно объяснить без визуальных средств: Изолируйте свободную от эндотоксина плазменную ДНК с помощью набора для приготовления макси без эндотоксина Sigma Aldrich в соответствии с протоколом производителя. Для этого эксперимента используйте три прозрачных 12-миллиметровых фильтра Transwell с размером пор 0,4 микрометра для посева.

Ячейки сидят четыре раза по 10 пятых ячеек MDCK на каждом фильтре. Через два дня рассмотрите культуру под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки растут в закрытом монослое. Для микроинъекций.

В день микроинъекции приготовьте 360 на 15 миллиметровые пластины по пять литров миллиметровой питательной среды плюс 15 миллиметровых хайс и поместите их в инкубатор с температурой 39 градусов Цельсия. Кроме того, приготовьте три 12-луночных планшета с одним миллилитром питательной среды MEM плюс 50 миллимолярных heis и 0,1 миллиграмма на миллилитр циклогексимида и поместите их в инкубатор с температурой 31 градус Цельсия. Включите микроинжекционный микроскоп, настроенный как этот инвертированный микроскоп с нагретым столиком 10 x и 32 x объективами, и einor femto jet.

Установите нагретую сцену на 39 градусов по Цельсию. Также откройте подачу газобаллона с азотом к воздушному столу. Теперь разбавьте ДНК фильтрованной водой до конечной концентрации 0,2 миллиграмма на миллилитр.

Затем вращают ДНК в микроцентрифуге эйнора при 13 000 об/мин в течение 30 минут. Снимите верхнюю часть и поместите в новую пробирку. Затем подготовьте клетки MDCK, вынув первый фильтр из чашки для культивирования хирургическим лезвием, вырежьте фильтр из фильтродержателя и поместите его в подготовленную пластину размером 60 на 15 миллиметров, содержащую пять миллилитров подогретых при температуре 39 градусов Цельсия питательных сред MEM плюс 50 миллимолярных heis.

Чтобы утяжелить фильтр в культуральной пластине, поместите хирургическое лезвие в центр фильтра, а затем перенесите культуральную пластину на нагретый столик микроскопа. Загрузите два-три микролитра разведенной ДНК в иглу для микроинъекций. Закрутите защитный чехол от иглы и дайте ей упасть на пол.

Чтобы поместить иглу в держатель, нажмите клавишу меню инъектора и убедитесь, что клапан закрыт. Вкрутите иглу в держатель. Остерегайтесь вкручивать иглу слишком сильно.

Так как это может привести к поломке, нажмите клавишу меню еще раз. Таким образом, приложенное компенсационное давление предотвратит всасывание среды в иглу во время процедуры микроинъекции. Наконец, нажмите на джойстик, чтобы стереть сохраненное самонаведение, чтобы опустить иглу на клетки.

Используйте объектив 10 x и поместите иглу в луч света над жидкостью. Теперь сосредоточьтесь на клетках. Снова сфокусируйтесь, повернув колесо фокусировки на 180 градусов вверх, и найдите иглу.

Медленно переместите иглу в фокус. Затем снова выведите его из фокуса. Работа над тем, чтобы снова сфокусировать клетки.

Снова опустите иглу в фокус. Повторяйте до тех пор, пока игла не коснется поверхности среды, в этой точке будет наблюдаться ореол. Продолжайте двигаться до точки, в которой клетки находятся в фокусе, но игла все еще нечетко выходит из фокальной плоскости.

Теперь переключитесь на цель 32 x и найдите настройки курса. Установите предел Z, коснувшись кончиком иглы апикальной мембраны и отняв около 10 микрометров. Поскольку ядра залегают примерно на 10 микрометров ниже апикальной мембраны.

Теперь как можно быстрее выведите иглу на пару микрон из фокальной плоскости. Прицельтесь иглой над ядром, а затем нажмите и отпустите кнопку инъекции джойстика. Начните с 95 фунтов на квадратный дюйм, чтобы найти правильное давление впрыска

Если давление слишком высокое, клетки взрываются. Если давление слишком низкое, белая точка сохраняется, но больше ничего не происходит. Выполните успешную инъекцию с фазовым переходом без изменения размера клеток.

Введите от 100 до 500 клеток в отверстие хирургического лезвия, которое лежит на клетках. Затем поместите клетки с чашкой для культивирования и хирургическим лезвием в инкубатор с температурой 39 градусов Цельсия и инкубируйте в течение двух часов. Наконец, перенесите клетки в подготовленный 12 лунок планшет объемом один миллилитр, МЕМ плюс 50 миллимоляров 0,1 миллиграмма на миллилитр, циклохейде и инкубируйте в течение двух часов при температуре 31 градус Цельсия.

Во избежание обесцвечивания выраженного сигнала GFP защищайте образцы от света, покрывая алюминиевой фольгой во время всех последующих процедур окрашивания поверхности. Поместите клетки в чашку для культивирования на металлическую пластину со льдом и промойте. После того как с ледяным холодом PBS plus plus, поместите чистый кусочек параформы на металлическую пластину на ледяную пипетку 30 микролитров капли антитела, которое распознает эктодомен интересующего белка.

Теперь поместите фильтр с клетками вверх ногами на каплю и добавьте несколько капель антител на заднюю сторону фильтра. Инкубировать в течение одного часа на льду. Промойте клетки трижды ледяным PBS plus plus и зафиксируйте 3%-ным параформным альдегидом на 15 минут при комнатной температуре.

Приступайте к промывке клеток один раз с помощью PBS plus plus и балансируйте в PBS plus plus в течение пяти минут. Теперь инкубируйте клетки в блокирующем проницаемом буфере. Инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре, развести первичные антитела от одного до 200 в BPB для обнаружения экспрессии RAB GTP ACE в течение 10 минут При дозаторе 13 000 об/мин 30 микролитров раствора антитела на чистую мембрану, помещенную во влажную камеру.

Поместите клетки на фильтре вверх ногами на капли антител и инкубируйте в течение одного часа. При комнатной температуре поместите ячейки обратной стороной вверх в 12. Хорошо промыть и промыть пять раз в течение 30 минут BPB при комнатной температуре после инкубации с соответствующими вторичными антителами, включая этап промывки.

Опустите ячейки на фильтре три раза в деионизированную воду и поместите ее правой стороной вверх на микрослайды при 10 микролитре монтирования Поместите сверху микростекло размером 18 на 18 миллиметров и, используя салфетки для лица, аккуратно прижмите защитный стекло к ячейкам. Наконец, запечатайте лаком для ногтей в имитационной инъекции только плазмиду, кодирующую V-S-V-G-T-S-O 45 GFP. Белок доставляется на базолатеральную поверхность хорошо поляризованных клеток MDCK, о чем судят по окрашиванию красной поверхности в клетках, которые не имеют хорошей поляризации.

Часть гибридного белка GFP будет доставляться к апикальной мембране. Если контрольные образцы выглядят таким образом, то нельзя доверять данным и эксперимент следует повторить с более хорошо поляризованными клетками. Обратите внимание, что не весь слияние экспрессии с GFP доставляется к базолатеральной мембране во время погони за 31 градусом Цельсия, о чем свидетельствует обширный внутриклеточный зеленый сигнал для общего белка

Этот метод проложил путь исследователям в области мембранного транспорта к изучению регуляторных белков в поляризованных эпителиальных клетках. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как экспрессировать белки в поляризованных эпителиальных клетках с помощью техники микроинъекций.