Сравнение сродства GTPase-связывающих белков, используя конкурентных анализах

Общая цель этой процедуры заключается в сравнении относительного сродства партнеров по связыванию белков для АПФ GT P семейства Row в тщательно контролируемых условиях загрузки нуклеотидов. Это достигается путем предварительной очистки предполагаемых конкурентных партнеров по связыванию, каждый из которых помечен одной и той же меткой, например, зеленым флуоресцентным белком или GFP. Второй шаг – очистка ГТФА от процентов.

Например, RAC one и загрузить его соответствующим нуклеотидом для достижения нужного сигнального состояния GTPA. Затем загруженный нуклеотидами ГТФА инкубируют с фиксированным количеством одного конкурента связывания и увеличивающимися количествами другого конкурента связывания для получения кривой титрования. Заключительным этапом является определение белков, связанных с иммобилизованной GT pase, с помощью вестерн-блоттинга и зондирование мембраны для метки GFP, которая является общей для двух партнеров по связыванию.

В конечном счете, вестерн-блот используется для определения относительных концентраций, при которых аналогичные количества каждого меченного GFP партнера по связыванию захватываются ГТФазой. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как совместное осаждение, заключается в том, что связывающие белки свойства GTPA продиктованы связанным нуклеотидом в клетке. Связанный нуклеотид лабилен, что затрудняет интерпретацию данных связывания с белками.

Начните эту процедуру с очистки помеченного GST G tpa и экспрессии связывающих белков GTPA, как описано в текстовом протоколе. РИН поместите колбы с трансфицированными клетками в фосфатный буферный раствор или PBS и слейте воду из колбы в течение пяти минут. Отсасывая свободную жидкость, затем соскребите клетки в 500 микролитрах буфера для лизиса в микропробирку, смешайте клетки для лизиса путем инверсии при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.

Во время лизиса промыть две партии по 40 микролитров шариков-ловушек GFP три раза со свежим буферным осадком для лизиса. Бусины при 2,700 умножении G на две минуты между стирками. После лизиса осветите лизаты центрифугированием при 21 000 G в течение 10 минут.

Перенесите осветленный лизат каждого из белков-конкурентов на отдельные промытые шарики-ловушки GFP. Дайте слитым белкам GFP связаться в течение двух часов, перемешивая путем инверсии при четырех градусах Цельсия. Промойте загруженные бусины ловушки GFP дважды в буфере для лизиса и дважды в соревновании.

Связывание буфера осаждения шариков при 2, 700 умножении на G в течение двух минут между стирками. Элюируйте гибридные белки GFP, добавив 40 микролитров 0,2 молярного глицина и пипетируя вверх и вниз в течение 30 секунд, немедленно осадите шарики в 21 000 раз G в течение 60 секунд и перенесите жидкость в новую пробирку, содержащую четыре микролитра одного молярного триса HCL, быстро выполните этот шаг, чтобы ограничить повреждение очищенного белка. Проанализируйте один микролитр каждого очищенного белка с помощью вестерн-блоттинга и зонда с антителом против GFP, чтобы установить относительный выход с помощью системы количественного блоттинга в соответствии с протоколом производителя.

Выравнивание концентрации молярного белка путем добавления буфера, связывающего конкуренцию. Возьмите 90 микролитров подготовленной стойки GST и трижды промойте нуклеотидным загрузочным буфером с помощью магнитопорошкового сортировщика для осаждения шариков на каждом этапе. Отсадите буфер из гранул и добавьте 100 микролитров буфера для загрузки нуклеотидов в зависимости от того, требуется ли загрузка нуклеотидов G-D-P-G-T-P или ее отсутствие.

Для проведения соревновательного эксперимента добавьте 12 микролитров 100 миллимолярных GDP, 12 микролитров 10 миллимолярных GTP гамма-S или без нуклеотидов к 60 микролитрам бортов GST для контроля загрузки нуклеотидов. Разделите оставшиеся бусины на три квата по 10 микролитров и добавьте в каждую пробирку два микролитра 100 миллимолярного GDP, два микролитра 10 миллимолярного ГТФ гамма-S или без нуклеотида. Выдержать шариковые смеси в течение 30 минут при температуре 30 градусов Цельсия с перемешиванием.

Стабилизируйте штатив со связующим нуклеотидом путем добавления одного моляра хлорида магния в экспериментальную смесь и контрольные смеси для выполнения соревновательного связывания. Установите шесть микропробирок. Каждый из них содержит 200 микролитров буфера для связывания соревнований.

Каждая пробирка также должна содержать 10 микролитров штатива, загруженного нуклеотидами, одну бусину и пять микролитров штатива. Один связывающий белок A в качестве постоянного связывающего белка в каждую пробирку добавьте 0 1 2 0,55, 10 или 20 микролитров rack один связывающий белок B в качестве переменного связывающего белка. Эти объемы предполагают примерно равные исходные концентрации постоянных и переменных связывающих белков и, возможно, потребуется скорректировать.

Доведите общий объем связующей смеси до 235 микролитров путем добавления конкурирующего связующего буфера. Затем установите микропробирку, содержащую 200 микролитров буфера для соревнований. 10 микролитров экспериментального нуклеотида загруженного штатива, один шарик и 10 микролитров штатива одного связывающего белка А. Затем установите G-D-P-G-T-P гамма-S и пробирки без нуклеотидов, как описано в текстовом протоколе.

Инкубируйте пробирки в течение двух часов, перемешивая путем инверсии при четырех градусах Цельсия после инкубации. Промойте бусины три раза с помощью буфера для связывания соревнований. Наконец, разбавьте связанные белки в 20 микролитрах буфера для редуцирующего образца.

Количественное вестерн-блоттинг метки GFP очищенного GFP RCC two и GFP Corona в одном домене C.Propeller показывает, что белок в верхней полосе, GFP RCC two, в 1,4 раза более распространен, чем в нижней полосе, и его следует разбавлять для достижения молярного соотношения один к одному для конкурентного эксперимента. Контрольный эксперимент показывает, что состояние загрузки нуклеотидов rack one диктует специфичность связывания: титрование увеличивающихся объемов GFP RCC two против фиксированного объема эквимолярной GFP Corona в одном домене пропеллера C и блоттинг. Белки, которые связываются со стойкой один, позволяют визуализировать относительное изменение связанного белка, отображая интенсивности полосы GFP для обоих конкурентов на одном и том же графике, и определяя точку, в которой линии пересекаются, позволяет определить объем переменного связывающего белка в равновесии.

Тем не менее, необходимо позаботиться о том, чтобы такие проблемы, как взаимодействие между конкурентами или избыток приманки gtpa, не ставили под угрозу эксперимент. Увеличение одного конкурента без потери другого, как показано здесь, указывает на проблему при попытке выполнить эту процедуру. Важно помнить о том, что существует взаимная связь между обилием конкурирующих связывающих партнеров.

Существует ряд проблем, которые могут исказить результаты или могут быть решены, если они будут выявлены путем проверки данных.