Сравнение сродства GTPase-связывающих белков, используя конкурентных анализах

Общая цель данной процедуры заключается в сравнении относительного сродства белков-партнеров по связыванию с GTPase семейства Row в тщательно контролируемых условиях загрузки нуклеотидов. Это достигается путем первоначальной очистки предполагаемых конкурентных партнеров по связыванию, каждый из которых помечен одной и той же меткой, например, зеленым флуоресцентным белком или GFP. Вторым этапом является очистка интересующей GTPase.

Например, активируйте RAC1 и нагрузите его соответствующим нуклеотидом для достижения желаемого сигнального состояния GTPA. Затем нагруженный нуклеотидом gtpa инкубируют с фиксированным количеством одного связывающего конкурента и возрастающими количествами другого связывающего конкурента для получения кривой титрования связывания. Заключительным этапом является разделение белков, связанных с иммобилизованной GT пазой, с помощью вестерн-блоттинга и зондирование мембраны на наличие GFP-метки, которая является общей для двух связывающих партнеров.

В конечном итоге вестерн-блоттинг используется для определения относительных концентраций, при которых ГТФаза захватывает равные количества каждого из партнеров по связыванию с GFP-меткой. Основное преимущество этого метода перед существующими способами, такими как ко-преципитация, заключается в том, что свойства связывания белков gtpa определяются связанным в клетке нуклеотидом. Связанный нуклеотид лабилен, что затрудняет интерпретацию данных о связывании белков.

Начните выполнение данной процедуры с очистки G tpa с GST-тегом и экспрессии белков, связывающих gtpa, согласно текстовому протоколу. Промойте колбы с трансфицированными клетками фосфатно-солевым буфером (PBS) и дайте жидкости стечь в течение пяти минут. После аспирации свободной жидкости снимите клетки с поверхности с помощью скребка в 500 µL лизирующего буфера в микроцентрифужную пробирку, затем перемешайте клетки путем переворачивания пробирки для лизиса при 4 °C в течение 30 минут.

Во время промывки при лизисе трижды промойте две порции по 40 µL GFP-trap-бусин свежим буфером для лизиса. Осаждайте бусины центрифугированием при 2 700 ×g в течение двух минут между промывками. После лизиса очистите лизаты путем центрифугирования при 21 000 ×g в течение 10 минут.

Перенесите осветленный лизат каждого из белков-конкурентов на отдельные промытые GFP-trap-биды. Оставьте GFP-слитые белки для связывания на два часа, перемешивая путем инверсии при 4 °C. Промойте нагруженные GFP-trap-биды дважды в лизис-буфере и дважды в буфере для конкуренции.

Осаждайте бусины в связывающем буфере при 2 700 ×g в течение двух минут между промывками. Элюируйте слитые белки GFP, добавив 40 µL 0,2 M глицина и перемешивая содержимое путем пипетирования вверх-вниз в течение 30 секунд; немедленно осадите бусины при 21 000 ×g в течение 60 секунд и перенесите жидкость в новую центрифужную пробирку, содержащую 4 µL 1 M Tris-HCl. Выполняйте этот этап быстро, чтобы ограничить повреждение очищенного белка. Проанализируйте 1 µL каждого очищенного белка с помощью вестерн-блоттинга и зондирования антителами к GFP для определения относительного выхода с использованием системы количественного блоттинга согласно протоколу производителя.

Выровняйте молярную концентрацию белка путем добавления буфера для конкурентного связывания. Возьмите 90 µL подготовленных бусин GST rack one и промойте их трижды буфером для нанесения нуклеотидов, используя магнитный сепаратор для осаждения бусин на каждом этапе. Удалите буфер с бусин и добавьте 100 µL буфера для нанесения нуклеотидов в зависимости от того, требуется ли добавление GDP, GTP или отсутствие нуклеотидов.

Для проведения конкурентного эксперимента добавьте 12 µL 100 mM GDP, 12 µL 10 mM GTP gamma S или не добавляйте нуклеотид к 60 µL шариков GST rack one для контроля загрузки нуклеотидов. Разделите оставшиеся шарики на три аликвоты по 10 µL и добавьте в каждую пробирку 2 µL 100 mM GDP, 2 µL 10 mM GTP gamma S или не добавляйте нуклеотид. Инкубируйте смеси с шариками в течение 30 минут при 30 °C при перемешивании.

Стабилизируйте стойку с привязанными нуклеотидами путем добавления 1 M хлорида магния к экспериментальной и контрольным смесям для проведения конкурентного связывания. Подготовьте шесть микроцентрифужных пробирок, каждая из которых содержит 200 µL буфера для конкурентного связывания.

В каждую пробирку также следует добавить 10 мкл загрузочного раствора нуклеотидов, одну порцию гранул и 5 мкл раствора. В качестве константного связывающего белка А в каждую пробирку добавьте 0, 1, 2, 0,55, 10 или 20 мкл раствора связывающего белка B в качестве переменного связывающего белка. Данные объемы предполагают примерно равные концентрации стоковых растворов константного и переменного связывающих белков и могут потребовать корректировки.

Доведите общий объем смеси для связывания до 235 µL, добавив буфер для конкурентного связывания. Затем подготовьте микроцентрифужную пробирку, содержащую 200 µL конкурентного буфера, 10 µL экспериментального нуклеотида, загруженного в рэк 1, бусины и 10 µL связывающего белка A из рэка 1. После этого подготовьте контрольные пробирки с GDP, GTPγS и без нуклеотида, как описано в текстовом протоколе.

Инкубируйте пробирки в течение двух часов, после чего перемешайте содержимое путем инверсии при температуре 4 °C. Промойте гранулы трижды буфером для конкурентного связывания. В завершение элюируйте связавшиеся белки в 20 µL восстанавливающего буфера для образцов.

Количественный вестерн-блоттинг GFP-метки очищенных белков GFP RCC two и GFP Corona in one C.Propeller domain показывает, что белок в верхней полосе, GFP RCC two, в 1,4 раза более обилен, чем в нижней полосе, и должен быть разведен для достижения молярного соотношения один к одному в эксперименте по конкуренции. Контрольный эксперимент демонстрирует, что статус загрузки нуклеотида rack one определяет специфичность связывания при титровании увеличивающихся объемов GFP RCC two против фиксированного объема эквимолярного GFP Corona in one C propeller domain с последующим блоттингом. Белки, которые связываются с rack one, позволяют визуализировать относительное изменение связанного белка; построение графиков интенсивности GFP-полос для обоих конкурентов на одном графике и определение точки пересечения линий позволяет установить объем вариабельного связывающего белка при равновесии.

Однако необходимо проявлять осторожность, чтобы такие проблемы, как взаимодействие между конкурентами или избыток приманки gtpa, не поставили под угрозу эксперимент. Увеличение количества одного конкурента без потери другого, как показано здесь, указывает на проблему при выполнении данной процедуры. Важно помнить о необходимости проверки наличия взаимной зависимости между количеством конкурирующих связывающих партнеров.

Существует ряд проблем, которые могут исказить результаты и/или которые можно устранить, если они будут выявлены в ходе анализа данных.