Карт и применение Enhancer-ловушки Выражение Flippase в личинок и взрослых Drosophila ЦНС

Общей целью данного эксперимента является уточнение экспрессии GAL 4 с помощью тканеспецифической липазы с инструментами преобразования GAL 80. Это достигается путем создания коллекции энхансеров ловушки Филиппа трансгенных линий мухи и определения паттерна экспрессии липазы в ЦНС в каждой линии. Используя репортер GFP, ИММУНОХИМИЮ и отчеты GFP могут дифференцировать GL от экспрессии нейронов для пересечения экспрессии GAL 4 в интересующих линиях ET переворачивать линии у мух, содержащих инструмент преобразования GAL 80 в потомстве.

Клональный анализ может быть использован для анализа уточнения выраженности GAL 4, например, в глазу. Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что линии на основе воспроизведения с усилителем дорожки вместе с инструментами конвертации GAL 80 можно использовать с быстрой коллекцией альянса GAL four, уже доступной в сообществе мух. Кроме того, эта концепция может быть расширена на другие новые модельные организмы GALI с четырьмя беспилотными летательными аппаратами, такие как рыбки данио.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в картировании поведения, лежащего в основе нейронных цепей. Несмотря на то, что этот протокол демонстрирует использование флип-базы в подмножестве фоторецепторных клеток, интерсекциональный метод может быть применен для анализа других тканей, включая ненейрональные ткани. По мере увеличения усилителя ловушки характеризуются линии липазы.

Подагра четыре США является важным методом, широко используемым биологами-мухами. Одним из предостережений большинства четырех линий GAL является то, что они выражены слишком широко, чтобы их можно было использовать для картирования поведения мозга с помощью пальцевых методов. Невозможно точно настроить экспрессию GAL four на футболках, представляющих интерес Перед использованием трансгена ET flip для частичного ограничения экспрессии четырех линий экспрессии GAL.

В первую очередь полезно знать паттерн экспрессии трансгена ET flip x two на поздней стадии развития лавы и у взрослых особей, чтобы визуализировать экспрессию ET A в ЦНС установил скрещивание между самцами с интересующим трансгеном ET t flip x two и девственными самками, содержащими репортера GFP для экспрессии ET flip от потомства. Соберите блуждающих личинок третьего возраста F1 для вскрытия. Поместите их в чистую S-защитную миску, удалите мусор кистью и промойте тарелку один раз одним PBS.

Теперь наполните чашку ледяным холодом один раз PBS, чтобы обезболить личинок, чтобы получить доступ к ЦНС лавы, подержите ее ротовой крючок с помощью пары щипцов. Захватите кутикулу возле вытягивающейся передней сферической области и отклейте ее назад. ЦНС остается прикрепленной к крючку для рта вместе с некоторыми другими структурами.

Теперь с помощью щипцов удалите все лишние структуры, окружающие ЦНС, во время рассечения ЦНС. Переложите их по отдельности в тарелку из трех миров Pyrex, наполненную PBS. После того, как все ЦНС будут рассечены, зафиксируйте их, полностью погрузив в 200 микролитров 4% PFA на лед.

Если ЦНС плавает, она не была полностью очищена от всех окружающих тканей. В этом случае с помощью пары щипцов погрузите ЦНС в фиксатор после фиксации на 15 минут, промойте ткань ледяным PB S3 раза, а затем промойте ткань еще три раза ледяным PBT. Теперь ткань готова к визуализации или мечению антителами или хранению в PBT при температуре четыре градуса Цельсия на последующий срок.

Окрашивание от того же креста использовалось для того, чтобы личинки собирали взрослых особей F1 перед вскрытием. Погрузите от пяти до 10 мух и охладите 95% этанол на 30 секунд, чтобы удалить воск с поверхности кутикулы. Чтобы удалить этанол, вымойте взрослых три раза ледяным холодом один раз PBS, а после третьего мытья переложите одного из них в 35-миллиметровую миску для защиты сила, наполненную ледяным холодом один раз PBS, чтобы подготовить взрослого к вскрытию.

Поместите его брюшной стороной вверх и вставьте булавку для миньонов посередине живота. Начните рассечение с помощью щипцов для удаления ног. Затем удалите кутикулу головы, закрепив головку у опор и одновременно отслаивая кутикулу из-под глаза по направлению к макушке головы.

Аккуратно с помощью заточенных щипцов извлеките, отслеживайте ткани, окружающие мозг, потому что след ваших тканей имеет сильную аутофлуоресценцию и это заставляет мозг плавать во время фиксации. Мозг является лишь частью ЦНС взрослого человека. Другая часть – это вентральный нервный канатик или VNC в грудной клетке, и он также должен быть рассечен.

Сначала удалите грудную кутикулу, закрепив ширинку у основания задней ноги и аккуратно оттянув грудную кутикулу вверх к основанию шеи. Во-вторых, чтобы обнажить VNC, аккуратно раздвиньте две половинки грудной кутикулы. В-третьих, удалите брюшную полость из грудной клетки, закрепив у основания второй ноги и оттянув брюшную полость от первого ночного взбалтывания.

В-четвертых, очистите VNC, закрепив в плечевой области и аккуратно оторвав ткань, окружающую VNC. Разорвите кольцо соединительной ткани, окружающее шейный соединительный отдел, и продолжайте удалять лишнюю ткань по мере сбора мозга. И VNC перекладывает их как груши в тарелку из девяти миров Pyrex, наполненную охлажденным одноразовым PBS, выдержанным на льду.

Чтобы закрепить взрослые ткани, погрузите их в 4%-ный PFA на лед на 15 минут. После ванны используйте три ледяные мойки PBS и три мойки PBT. Теперь ткань готова к визуализации или мечению антителами для точного анализа экспрессии трансгенов.

Полезно пометить ЦНС нейрональными или глиальными маркерами, чтобы обеспечить систему отсчета, начните с инкубации ткани при четырех градусах Цельсия в течение ночи с антителами к нейронам или глии на следующий день. Промойте препарат пять раз PBT и инкубируйте с флуоресцентным вторичным антителом при комнатной температуре в течение двух часов. Оберните планшет и фольгу, чтобы предотвратить фотообесцвечивание антител после окончания инкубации.

Промойте препарат PBS и полностью установите препарат на предметную горку. Используйте пластиковое кольцо OSHA, чтобы предотвратить раздавливание ткани защитным стеклом. Теперь нервная система готова к исследованию паттернов экспрессии GFP и LL под флуоресцентным микроскопом.

Как правило, от трех до пяти реплик исследуются для определения воспроизводимости шаблона экспрессии flip. Паттерн экспрессии flip в flip, линия может быть использована вместе с другими трансгенами для изменения экспрессии репрессора GAL 4 GAL 80. Изменение экспрессии репрессора GAL 80 является эффективным методом внесения изменений.

При экспрессии GAL 4 одним из методов является выворачивание экспрессии GAL 80 с помощью трансгена Экспрессия GAL 80 инактивирует GAL 4, что в противном случае приводит к дегенерации глаза по всему глазу. Хеш перевернутой линии ET 6 88 A используется здесь для оценки эффективности инструмента преобразования GAL 80 в подмножестве фоторецепторов в потомстве F1, сравнения фенотипа глаза с фенотипом глаза родительских штаммов. Любое появление деформации глаза или депигментации подтверждает, что в фоторецепторах присутствует паттерн флип-экспрессии, и GAL 80 flipout был успешным.

Комплиментарная неизбыточная стратегия заключается в том, чтобы перевернуть выражение GAL 80 с использованием той же интересующей линии переворота. Эта стратегия очень похожа на другую, но теперь пигментация и дегенерация ID в потомстве F1 подавляются. В сальто Х два.

Экспрессия фоторецепторов После освоения вскрытия ЦНС может быть выполнена примерно за пять минут для взрослых особей и одну минуту для личинок, если она выполнена правильно. При попытке этой процедуры важно использовать острые щипцы для удаления трахеи и тканей, окружающих как взрослого, так и Libre C, Ss.It важно использовать нефиксирующую чашку для рассечения. В настоящее время Heat Shock Flip используется для генерации случайных клонов.

В отличие от этого, enhancer trap flip is позволяет создавать воспроизводимые клоны, облегчая морфологический и поведенческий анализ. Еще одно преимущество пальцевого метода заключается в том, что можно еще больше ограничить четыре паттерна экспрессии GAL с помощью дополнительных линий на основе переворота анана-ловушки и других линий gal. Слабость конфигурации тубулинового стопа GAL 80 заключается в том, что некоторые комбинации GA 4 и эффекторов БАС, такие как LAG 4 и U-A-S-K-I-R, несовместимы, потому что они убивают мух.

Эту проблему можно легко решить с помощью условного эффектора БАС, такого как БАС Shiri Ts, который позволяет исследовать поведение при ожидаемых ограничительных температурах. Не все линии липазы, усиливающие ловушки, экспрессируют достаточно высокие уровни липазы, чтобы быть полезными. Тем не менее, описанная здесь техника пальцев предоставляет исследователям дрозофил новый подход к уточнению мозаичного анализа как для схем развития, так и для поведения.