Характеризуя Бактериальные Летучие использованием вторичного Электроспрей ионизации масс-спектрометрия (СЕСИ-MS)

Вторичная ионизация электронным распылением, масс-спектрометрия или CS EMS позволяет анализировать бактериальные летучие вещества без необходимости использования какого-либо образца. Предварительная обработка. Пространство для бактериальной культуры вытесняется углекислым газом в реакционную камеру cssi. Когда летучие вещества проходят через реакционную камеру SSI, они проходят через облако электроаэрозоля и ионизируются.

После ионизации летучие вещества втягиваются в масс-спектрометр для анализа. Избыток газа-носителя и нереактивные бактериальные летучие вещества пропускаются через фильтр размером 0,22 микрона для удаления любых бактериальных агентов в качестве дополнительной меры защиты вентиляционного отверстия в химическом колпаке. В конечном счете, этот протокол CSI MS предлагает обнаружение бактериальных летучих отпечатков пальцев в течение нескольких минут.

Мы ожидаем, что эта технология может быть использована во многих приложениях, включая выдох, анализ дыхания на инфекционные заболевания или даже в продовольственных системах, где мы сможем быстро обнаруживать патогены, которые находятся на нашей пище или в ней. Можно выделить несколько основных преимуществ этой методики. По сравнению с существующими методами, такими как GCMS sift, MS и PT, сначала RM S, летучие вещества не требуют предварительной обработки перед анализом.

Во-вторых, в летучей смеси можно фрагментировать определенные ионы, что облегчает идентификацию соединений. И в-третьих, это быстро. Обычно это занимает менее пяти минут.

Чтобы проанализировать каждый образец, выберите подходящий сосуд для выращивания вашей культуры, учитывая потребности в росте вида, а также эффективную доставку летучих веществ в масс-спектрометр. В этой демонстрации мы выбрали стандартные 100-миллилитровые бутылки для фильтрующего материала. Бактериальные летучие вещества доставляются в масс-спектрометр потоком газа-носителя для сборки носителя.

Газовые магистрали подходят для бутылок с культурой с резьбовыми крышками, которые имеют не менее двух отверстий для приманки. Вставьте впускной и выпускной трубопроводы газа через отверстия для приманки и заткните все дополнительные порты перед посевом образцов. Нагнетайте давление в сосудах и погрузитесь в воду, чтобы проверить наличие утечек.

Утечки газа являются основной причиной нетипичных результатов в виде слабых или отсутствующих результатов. Сигналы летучих ионов нарастают в одночасье. Культуры кишечной палочки, K 12 и pseudomonas aerogen, PAO One в LB Lennox готовят по две биологические репликации для каждого вида.

Подготовьте девять стерильных флаконов для культивирования, содержащих 50 миллилитров LB Lennox и одну неинокулированную бутылку, для использования в качестве заготовки. Создание технических реплик, инкубация культур и заготовки в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Поскольку CEMS специально разработан для отбора проб летучих веществ, перед использованием прибора строго ограничьте использование ароматических средств личной гигиены.

Закройте все летучие химические вещества в лаборатории и максимально контролируйте сквозняки воздуха во время испытаний, чтобы предотвратить загрязнение прибора и трубопроводов подачи газа. С жизнеспособными биологическими агентами установите фильтры соответствующего размера пор в магистраль газа-носителя. Фильтры не будут препятствовать переносу летучих веществ в реакционную камеру сеси, но могут незначительно повлиять на эффективность переноса аэрозоля.

Чтобы убедиться в том, что напряжение отключено и в системе отключено электричество, проверьте световые индикаторы на источнике напряжения. Убедитесь, что напряжение на мультиметре равно нулю, и заземлите электрические провода. В это время установите раствор для электрораспыления для анализа.

В режиме положительных ионов мы используем раствор электрораспыления, состоящий из 0,1% муравьиной кислоты, 5% метанола и 94,9% воды Чтобы добиться оптимальной интенсивности и стабильности сигнала, включите газ-носитель углекислого газа и установите скорость потока на два литра в минуту. Надавите на резервуар для электрораспыления, чтобы инициировать подачу раствора электрораспыления в реакционную камеру со скоростью потока пять нанолитров в секунду. Далее включите подачу напряжения и отрегулируйте напряжение на 2,5 киловольта.

Приложенное напряжение влияет на интенсивность ионов сигнала и стабильность электронапыляемого конуса Tailor для нашей системы напряжения от двух до пяти киловольт. Обеспечьте наилучшие результаты в режиме положительных ионов Будьте осторожны, так как в этот момент металлические поверхности источника ионизации способны нанести опасный удар. Теперь настройте метод настройки для мониторинга спектра SEMS.

Снимите флажок Захват нескольких каналов или MCA. Установите время сбора данных на 10–15 минут и начните сбор данных. Наблюдайте за спектрами фона газа-носителя и вносите тонко настроенные корректировки приложенного напряжения для получения стабильной хроматограммы общего иона и воспроизводимых сканов.

Продолжайте собирать спектры и A TIC в течение пяти минут, чтобы убедиться, что прибор стабилизирован с помощью застрахованного прибора. Введите параметры сбора данных в соответствии с вашим экспериментом. Запись фонового спектра газа-носителя для будущих экспериментов.

Чтобы собрать пустой Spectrum. Направьте поток газа-носителя через байпасные линии, а затем присоедините заготовку с закрытыми клапанами к передаточным линиям прибора. Откройте клапаны для бутылки с образцом и закройте клапаны байпасных линий.

Для воспроизводимых спектров. Дайте системе уравновеситься в течение 30 секунд, в течение которых влажность в реакционной камере стабилизируется. Чтобы убедиться в том, что система находится в равновесии, контролируйте TIC, который будет меняться в течение периода равновесия с последующей стабилизацией.

Как только система будет сбалансирована, начните сбор спектра. После того, как спектр будет собран, извлеките бутылку с образцом, сначала открыв байпасные линии газа-носителя. Затем закройте клапаны для отбора проб.

И, наконец, снятие бутылки с образцом. Промойте систему газом-носителем в течение двух-четырех минут, чтобы удалить влагу и поглощенные летучие вещества из передаточных линий и предотвратить перенос образца в образец. Собирайте летучие данные отпечатков пальцев для каждого образца бактерии, периодически собирая дополнительные пустые спектры для обеспечения тщательного вычитания пустых образцов.

Положительный ионный режим летучих отпечатков пальцев для кишечной палочки и фосфорного аэрогена. Выращенный аэробно в LB Lennox в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия отличается. В летучем спектре кишечной палочки доминирует индус с отношением массы к заряду 118, в то время как спектр аэрогена pseudomonas содержит большее разнообразие пиков, добавляемых к белкам.

При выполнении этой процедуры важно записать инструментальные параметры, оптимизированные для анализа, такие как приложенное напряжение, состав раствора электрораспыления и расход газа-носителя. Также важно, чтобы вы вели записи репрезентативных спектров, чтобы вы могли воспроизвести свои анализы в будущем. Не забывайте, что работа с болезнетворными микроорганизмами и высоким напряжением может быть чрезвычайно опасной.

Поэтому всегда следует принимать меры предосторожности, такие как ограничение доступа к css CMS во время эксперимента. Таким образом, теперь вы должны иметь возможность воспроизводимо получать спектры CSS, EMS для летучих веществ бактерий в вашей системе. Удачи.