Мозаика Анализ функции генов в постнатальном развитии мозга мыши с помощью вирусов основан Cre Рекомбинация
1 августа 2011 г.
В естественных условиях Метод для тестирования функции генов в послеродовом мозга описывается. Рекомбинантный AAVs выражения Cre и / или флуоресцентного белка вводят в мозг новорожденных мышей. Мозаика инактивации гена и редкие нейронов маркировки будут достигнуты, позволяя быстрый анализ функции генов в процессах решающее значение для развития нервной цепи.
Общая цель этой процедуры заключается в манипулировании функцией генов в постнатальный период развития мозга. Это достигается путем предварительного отбора и подготовки соответствующих вирусов, загрузки их в шприц и подготовки инъекционного оборудования. Затем вирус вводится в мозг новорожденных мышиных детенышей, и последним шагом является принесение животных в жертву и визуализация введенных областей.
В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают дифференциальное мечение контрольных и нокаутных клеток с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, как генетически регулируется период постнатального развития. Для инъекций коммерчески доступный раствор аденоассоциированного вируса может быть использован в полном титре, обычно от 10 до 12, копий генома на миллилитр для манипулирования большим количеством клеток.
Если требуется разрежение или маркировка, начните с разбавления от одного до 10. После размораживания вируса на льду немедленно перенесите объем предварительного разведения в стерильную ПЦР-пробирку объемом 250 микролитров. Держите разбавление на льду. Сейчас.
Подготовьте инъекционный насос, выбрав подходящий шприц и подсоединив его к загрузочной игле. Затем осторожно набирайте раствор вируса до тех пор, пока в шприце не появится очень маленький пузырь воздуха, и можно использовать инертный загружающий краситель, чтобы облегчить этот шаг. Теперь закрепите шприц на насосе с помощью фиксатора.
Затем аккуратно прикрепите соединительную трубку между шприцем и иглодержателем. Убедитесь, что игла для инъекций находится в непосредственном контакте с соединительной трубкой внутри иглодержателя. Теперь медленно перемещайте раствор по соединительной трубке, пока на кончике иглы не будет видна крошечная капля раствора.
Аккуратно закрепите поршень рядом с блоком толкателя с помощью кронштейна на насосе. Установите скорость впрыска равной восьми микролитрам в минуту и объем инъекции в диапазоне от одного до двух микролитров. Затем отрегулируйте настройку диаметра шприца насоса в соответствии с диаметром используемого вами шприца.
Наконец, чтобы защитить щенков во время фазы восстановления, установите горячую плиту на 38 градусов Цельсия и накройте ее бумажным полотенцем. Используя протокол, одобренный IACUC, подготовьте детенышей мыши P zero или P one к инъекции, подвергнув их холодной анестезии. Смочите несколько бумажных полотенец водой и положите их на лед.
Затем поместите четырех или пятерых щенков на хорошо отделенное от него бумажное полотенце. Сложите бумажные полотенца на щенков, аккуратно положите небольшое количество колотого льда поверх бумажных полотенец и высиживайте щенков около пяти минут. Щенков можно безопасно держать на льду до 15 минут, и они все еще будут хорошо восстанавливаться.
Теперь поместите щенка под наркозом на монтажный блок для лучшего доступа к месту инъекции. К коре головного мозга, например, легче всего получить доступ, положив животное на живот. Щенка можно закрепить на месте с помощью пластыря, вручную стабилизировать голову щенка и плотно натянуть кожу, чтобы она не двигалась.
Затем ориентируйтесь по анатомическим ориентирам черепа по типу лямбда-шва, а другой рукой выберите воспроизводимую точку инъекции, аккуратно введите иглу через череп. Не нажимайте сильно, если игла не легко проникает в череп. Вместо этого измените положение иглы и осторожно повторите попытку.
Глубина инъекции немного варьируется у разных животных и штаммов для коры головного мозга, обычно работает глубина от половины до одного миллиметра. Теперь введите раствор вируса, попросив коллегу активировать насос, чтобы свести к минимуму движения рук. В идеале для запуска насоса после впрыска можно использовать ножную педаль.
Удерживайте иглу на месте в течение нескольких секунд, затем плавно удерживая голову щенка. Выдвиньте иглу. Теперь дайте щенку восстановиться в течение пяти-10 минут на закрытой горячей плите.
В течение этого времени продолжайте вводить инъекции другим щенкам. Когда все щенки вернут свой розовый цвет и начнут двигаться, аккуратно потрите их частью домашней подстилки. Только после этого они могут быть возвращены матери.
В противном случае с ними можно обращаться как с незнакомыми щенками, которых мать, скорее всего, убьет после того, как детеныши будут возвращены матери. Очистите установку для инъекций, полностью загрузив шприц ацетоном или 70%-ным этанолом. Если используются чувствительные к ацетону компоненты, такие как sano, acurate, адгезивы, промойте раствор через инъекционную установку несколько раз, используя каждый раз свежий раствор.
Это удалит остатки вирусного раствора и приведет к выпадению растворителей в осадок. После промывки установки продезинфицируйте рабочую зону отбеливателя, чтобы оставить ее готовой для следующего экспериментатора. Наставник. Успешная техника приводит к сильному нейронному инфицированию в месте инъекции.
Инъекции в определенные области, такие как кора головного мозга и верхний холмик, обычно вызывают местные инфекции с минимальным распространением на соседние области. Использование раствора вируса с высоким титром делает инфекцию соседних областей, таких как гиппокамп, более вероятной инъекцией раствором вируса с низким титром. Приводит к редкой инфекции, как правило, вблизи места инъекции, как и мозжечковая инъекция по средней линии, количество инфицированных клеток должно коррелировать с титром введенного вирусного раствора.
Например, введение в мозжечок смеси растворов с высоким титром двух вирусов R AAV 8, экспрессирующих различные флуоресцентные белки, инфицирует многие клетки киндзи, которые по-разному мечены. И наоборот, введение раствора вируса с низким титром может привести к редкой инфекции, что поможет визуализировать отдельные клетки. Флуоресцентно меченые нейроны можно наблюдать непосредственно в свежесрезанных живых тканях, либо подвергать их иммуноокрашиванию.
Это усиливает эндогенные флуоресцентные сигналы для последующего получения изображений с помощью широкопольной или конфокальной флуоресцентной микроскопии. Наконец, RAAV 8 способен заражать различные типы нейронов в коре головного мозга с сильным обозначением тонких процессов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В этой статье описан метод in vivo для исследования функции гена в процессе послеродового развития мозга с использованием рекомбинантных ААВ. Введение этих вирусов в мозг новорожденных мышей позволяет исследователям достичь мозаичной инактивации генов и разреженного метки нейронов, что облегчает анализ функции генов в развитии нейронных цепей.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Функция гена
- Развитие нейронных цепей
Бакграунд
- Понимание функции гена в процессе послеродового развития мозга является критически важным.
- Рекомбинантные ААВ могут быть использованы для манипуляции экспрессией генов.
- Этот метод позволяет исследовать генетическую регуляцию в критические периоды развития.
- Иммунофлюоресцентная микроскопия может различать контрольные и нуль-клетки.
Цель исследования
- Манипуляция функцией гена в послеродовый период развития мозга.
- Исследование того, как генетические факторы регулируют послеродовое нейронное развитие.
- Получение представления о механизмах, лежащих в основе формирования нейронных цепей.
Используемые методы
- Выбор и подготовка соответствующих рекомбинантных ААВ.
- Введение вирусов в мозг новорожденных мышат.
- Иммунофлюоресцентная микроскопия для визуализации введенных регионов.
- Анализ дифференциальной метки контрольных и нуль-клеток.
Основные результаты
- Успешная инактивация генов и метка нейронов достигнута.
- Результаты демонстрируют генетическую регуляцию послеродового развития.
- Метод предоставляет основу для будущих исследований в области нейронаук.
- Полученные знания могут улучшить понимание динамики нейронных цепей.
Выводы
- Этот метод эффективен для изучения функции генов в развивающемся мозге.
- Результаты способствуют пониманию развития нейронных цепей.
- Будущие исследования могут опираться на этот подход для изучения генетического влияния на поведение.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, scalable interrogation of gene function in postnatal brain development, addressing a critical gap in target validation for neurodevelopmental disorders. By bypassing embryonic lethality constraints, it supports mechanistic de-risking of therapeutic targets in pathways relevant to autism and schizophrenia. The approach provides predictive confidence in target selection by linking genetic perturbation to circuit-level phenotypes in a physiologically relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in postnatal neural circuits where many neurodevelopmental disorder genes exert their effects.
- Operational Value: Achieves mosaic gene inactivation and sparse labeling within days, avoiding months-long conditional mouse model generation.
- Scientific Value: Supports cell-autonomous functional analysis of genes implicated in axonal growth, dendritic tiling, and synapse refinement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively comparable control and knockout cell populations via differential fluorescent labeling for side-by-side phenotypic assessment.
- Operational Value: Permits titration of viral titer to modulate infection density, enabling scalable sparse or dense labeling as needed for downstream assays.
- Scientific Value: Compatible with immunofluorescence and electrophysiology readouts, facilitating multimodal validation of target engagement and circuit impact.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models postnatal genetic perturbation in mice and rats, aligning with the developmental timing of human neuropsychiatric disorder onset.
- Operational Value: Extends to lentiviral delivery and shRNA/dominant-negative constructs, broadening target modulation toolkit for preclinical validation.
- Scientific Value: Enables study of gene function in critical processes like synapse formation, directly relevant to pathophysiological mechanisms in psychiatric disorders.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by providing causal genetic evidence in postnatal neural circuits prior to compound screening.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by deleting candidate genes in defined brain regions to assess phenotypic consequences on neural circuit maturation.
- Screening: Produces standardized, reproducible neuronal preparations with internal controls (labeled vs. unlabeled cells) for reliable compound effect measurement.
- Analytics: Generates quantitative imaging and electrophysiology readouts that enable statistical comparison of genotypes and treatment conditions.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to circuit-level outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation of target modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable viral delivery platform applicable across multiple gene targets and brain regions, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking postnatal gene loss to specific circuit phenotypes.
- Operational Value: Standardizes gene perturbation via viral delivery, improving reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly establishing genetic causality in disease-relevant postnatal windows.
- Portfolio Impact: De-risks target advancement by providing functional evidence in systems that model human neurodevelopmental timing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal mouse handling, stereotaxic injection, and viral biosafety protocols.
- Dependent on access to purified recombinant AAV or lentiviral vectors and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of viral titer, injection volume, and anesthesia procedures for cross-study consistency.
- Adaptation to different brain regions or species may require optimization of injection coordinates and viral serotype tropism.
- Practical limitation: Efficacy depends on Cre recombinase efficiency and floxed allele availability, which may vary across targets.
