Мозаика Анализ функции генов в постнатальном развитии мозга мыши с помощью вирусов основан Cre Рекомбинация

Общая цель этой процедуры заключается в манипулировании функцией генов в постнатальный период развития мозга. Это достигается путем предварительного отбора и подготовки соответствующих вирусов, загрузки их в шприц и подготовки инъекционного оборудования. Затем вирус вводится в мозг новорожденных мышиных детенышей, и последним шагом является принесение животных в жертву и визуализация введенных областей.

В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают дифференциальное мечение контрольных и нокаутных клеток с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, как генетически регулируется период постнатального развития. Для инъекций коммерчески доступный раствор аденоассоциированного вируса может быть использован в полном титре, обычно от 10 до 12, копий генома на миллилитр для манипулирования большим количеством клеток.

Если требуется разрежение или маркировка, начните с разбавления от одного до 10. После размораживания вируса на льду немедленно перенесите объем предварительного разведения в стерильную ПЦР-пробирку объемом 250 микролитров. Держите разбавление на льду. Сейчас.

Подготовьте инъекционный насос, выбрав подходящий шприц и подсоединив его к загрузочной игле. Затем осторожно набирайте раствор вируса до тех пор, пока в шприце не появится очень маленький пузырь воздуха, и можно использовать инертный загружающий краситель, чтобы облегчить этот шаг. Теперь закрепите шприц на насосе с помощью фиксатора.

Затем аккуратно прикрепите соединительную трубку между шприцем и иглодержателем. Убедитесь, что игла для инъекций находится в непосредственном контакте с соединительной трубкой внутри иглодержателя. Теперь медленно перемещайте раствор по соединительной трубке, пока на кончике иглы не будет видна крошечная капля раствора.

Аккуратно закрепите поршень рядом с блоком толкателя с помощью кронштейна на насосе. Установите скорость впрыска равной восьми микролитрам в минуту и объем инъекции в диапазоне от одного до двух микролитров. Затем отрегулируйте настройку диаметра шприца насоса в соответствии с диаметром используемого вами шприца.

Наконец, чтобы защитить щенков во время фазы восстановления, установите горячую плиту на 38 градусов Цельсия и накройте ее бумажным полотенцем. Используя протокол, одобренный IACUC, подготовьте детенышей мыши P zero или P one к инъекции, подвергнув их холодной анестезии. Смочите несколько бумажных полотенец водой и положите их на лед.

Затем поместите четырех или пятерых щенков на хорошо отделенное от него бумажное полотенце. Сложите бумажные полотенца на щенков, аккуратно положите небольшое количество колотого льда поверх бумажных полотенец и высиживайте щенков около пяти минут. Щенков можно безопасно держать на льду до 15 минут, и они все еще будут хорошо восстанавливаться.

Теперь поместите щенка под наркозом на монтажный блок для лучшего доступа к месту инъекции. К коре головного мозга, например, легче всего получить доступ, положив животное на живот. Щенка можно закрепить на месте с помощью пластыря, вручную стабилизировать голову щенка и плотно натянуть кожу, чтобы она не двигалась.

Затем ориентируйтесь по анатомическим ориентирам черепа по типу лямбда-шва, а другой рукой выберите воспроизводимую точку инъекции, аккуратно введите иглу через череп. Не нажимайте сильно, если игла не легко проникает в череп. Вместо этого измените положение иглы и осторожно повторите попытку.

Глубина инъекции немного варьируется у разных животных и штаммов для коры головного мозга, обычно работает глубина от половины до одного миллиметра. Теперь введите раствор вируса, попросив коллегу активировать насос, чтобы свести к минимуму движения рук. В идеале для запуска насоса после впрыска можно использовать ножную педаль.

Удерживайте иглу на месте в течение нескольких секунд, затем плавно удерживая голову щенка. Выдвиньте иглу. Теперь дайте щенку восстановиться в течение пяти-10 минут на закрытой горячей плите.

В течение этого времени продолжайте вводить инъекции другим щенкам. Когда все щенки вернут свой розовый цвет и начнут двигаться, аккуратно потрите их частью домашней подстилки. Только после этого они могут быть возвращены матери.

В противном случае с ними можно обращаться как с незнакомыми щенками, которых мать, скорее всего, убьет после того, как детеныши будут возвращены матери. Очистите установку для инъекций, полностью загрузив шприц ацетоном или 70%-ным этанолом. Если используются чувствительные к ацетону компоненты, такие как sano, acurate, адгезивы, промойте раствор через инъекционную установку несколько раз, используя каждый раз свежий раствор.

Это удалит остатки вирусного раствора и приведет к выпадению растворителей в осадок. После промывки установки продезинфицируйте рабочую зону отбеливателя, чтобы оставить ее готовой для следующего экспериментатора. Наставник. Успешная техника приводит к сильному нейронному инфицированию в месте инъекции.

Инъекции в определенные области, такие как кора головного мозга и верхний холмик, обычно вызывают местные инфекции с минимальным распространением на соседние области. Использование раствора вируса с высоким титром делает инфекцию соседних областей, таких как гиппокамп, более вероятной инъекцией раствором вируса с низким титром. Приводит к редкой инфекции, как правило, вблизи места инъекции, как и мозжечковая инъекция по средней линии, количество инфицированных клеток должно коррелировать с титром введенного вирусного раствора.

Например, введение в мозжечок смеси растворов с высоким титром двух вирусов R AAV 8, экспрессирующих различные флуоресцентные белки, инфицирует многие клетки киндзи, которые по-разному мечены. И наоборот, введение раствора вируса с низким титром может привести к редкой инфекции, что поможет визуализировать отдельные клетки. Флуоресцентно меченые нейроны можно наблюдать непосредственно в свежесрезанных живых тканях, либо подвергать их иммуноокрашиванию.

Это усиливает эндогенные флуоресцентные сигналы для последующего получения изображений с помощью широкопольной или конфокальной флуоресцентной микроскопии. Наконец, RAAV 8 способен заражать различные типы нейронов в коре головного мозга с сильным обозначением тонких процессов.