Трехмерная реконструкция человеческой кожи Модель: инструмент для изучения нормальной кожи и меланомы Прогрессия

Общая цель этой процедуры заключается в создании 3D-реконструкции кожи человека для изучения меланоцитов, меланомы и биологии стволовых клеток кожи. Это достигается путем предварительного покрытия вкладыша лотков для тканевых культур нейтрализованным бычьим коллагеном. Второй шаг – сделать клеточный дермальный компартмент из фибробластов и коллагена.

Далее сделайте эпидермальный компартмент из кератиноцитов, смешанных с меланоцитами или клетками меланомы. Заключительным этапом процедуры является забор кожной реконструкции на 18-й день и пересадка кожной реконструкции мыши. В конечном счете, иммуногистохимический и иммунофлуоресцентный анализы трансплантата показывают архитектуру нормальной кожи, содержащую меланоциты, миграцию и дифференцировку нормальных стволовых клеток и фенотипы меланомы, специфичные для стадии.

Мы разработали модель реконструкции кожи 20 лет назад, потому что на ранних этапах наших исследований мы обнаружили, что нормальные меланоциты или клетки меланомы, которые культивируются на чашке, ведут себя совсем не так, как клетки, которые находятся в тканевом контексте. Таким образом, модель реконструкции кожи идеально подходит для того, чтобы увидеть, как клетки перемещаются из одного отсека кожи в любое другое место. Заранее приготовленный бесклеточный слой коллагеновой смеси выложить на лед, а затем добавить по одному миллилитру соломенно-желтого раствора в каждую вставку из шестерки.

Хорошо вытесните лоток для культуры тканей в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы гель успел застыть. В течение этого времени раствор должен менять цвет с желтого на розовый, пока гель затвердевает трипсином глаз, человеческий фибрбласт из их культуральной колбы с 0,25% трипсин ЭДТА через пять минут. Добавьте DMEM, содержащий 10% FBS, чтобы нейтрализовать процесс издания.

Оторвавшиеся клетки соберите центрифугированием в течение пяти минут при 200 G при комнатной температуре, а затем повторно суспендируйте клетки в соотношении 4,5 умножить на 10 до пятой клетки на 1,5 миллилитров. DMEM с добавлением 10% FBS. Далее заполните 50 миллилитровую трубку заранее приготовленной смесью клеточного слоя коллагена и поместите трубку на лед.

Добавьте в пробирку 1,5 миллилитра суспензии фибробластов и перемешайте.Хорошо. Добавьте три миллилитра раствора соломенно-желтого слоя клеточного слоя в каждую вкладыш, покрытую бесклеточным слоем. Затем инкубируйте лоток для тканевых культур в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур с содержанием углекислого газа 5% в течение инкубационного периода.

Цвет раствора клеточного слоя также должен меняться с желтого на розовый. После того как верхний слой геля застынет, добавьте два миллилитра DMEM, содержащего 10% FBS, внутрь вкладыша в лоток для культуры тканей и 10 миллилитров снаружи вкладыша. Инкубируйте лотки для культуры тканей в течение четырех дней.

Проверив на четвертый день, что гель сокращается на четвертый день инкубации, можно аспирировать среду как изнутри, так и снаружи каждой вставки. Добавьте два миллилитра средства для умывания внутрь и 10 миллилитров наружу вкладышей, чтобы смыть обычную сыворотку. Затем инкубируйте лотки в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия для образования эпидермиса.

Во-первых, трипсин – это кератиноциты человека. Затем, через пять минут, используйте ингибитор соевого трипсина, чтобы нейтрализовать трипсин после раскручивания отделенных клеток при 200 G в течение пяти минут. Реус суспендирует клеточную гранулу в соотношении 4,17 умножить на 10 к шести клеткам на миллилитр в коже.

Восстановите среду после забора кератиноцитов. Трипсин замораживает меланоциты человека в течение одной-двух минут. Опять же, нейтрализуйте трипсин ингибитором соевого трипсина.

Затем, после раскручивания клеток в тех же условиях, что и раньше, повторно суспендируйте гранулу меланоцитов в соотношении 8,3 умножить на 10 к пятой клетке на миллилитр в коже. Восстановим и средний. Далее удалите моющее средство как изнутри, так и снаружи каждой вставки дермального слоя подготовленного лотка для культуры тканей.

Замените средство для умывания, добавив 1,5 миллилитра кожицы, реконструируйте среду, по одному внутрь и по 10 миллилитров наружу каждой вставки. Затем смешайте 600 микролитров суспензии клеток кератиноцитов с 600 микролитрами суспензии меланоцитов. Дозируйте 200 микролитров смешанной клеточной суспензии.

По капле внутрь каждой вставки. Инкубируйте лоток для культуры тканей в течение двух дней при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации клеток аспирируйте кожу, восстановите среду по одной изнутри и снаружи каждой вставки, а затем добавьте два миллилитра кожи, реконструируйте среду, две внутрь и 10 миллилитров снаружи вставки.

Затем инкубируйте реконструкцию еще два дня при температуре 37 градусов по Цельсию. После второго двухсуточного инкубации аспирируют кожу, реконструируют среду по два изнутри и снаружи каждого вставки. Теперь добавляем 7,5 миллилитров кожицы, реконструируем средние три только к внешней стороне вкладышей.

Поместите реконструкцию обратно в инкубатор и смените кожу. Восстанавливайте среду три через день до 18 дня. На 18-е сутки инкубации аспирируют среду изнутри и снаружи вставок кожи, реконструируют загруженный лоток для культуры тканей.

Извлеките вкладыши из лотка с помощью щипцов. Вырежьте конструкцию, включая поликарбонатный фильтр, проведя лезвием скальпеля круг близко к краю. Затем поместите реконструкцию в фильтр на твердую поверхность и разрежьте их пополам лезвием.

Поместите одну половину реконструкции на черную биопсийную бумагу TBS, а затем поместите бумагу в гистологическую кассету. Замочите всю кассету в 10% формалине более чем на четыре часа. Затем поместите кассету в 70% этанол и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока вы не будете готовы к обработке реконструкции для заделки парафина.

Поместите вторую половину реконструкции, в 50% сахарозу при температуре четыре градуса Цельсия на один-два часа. Затем замените сахарозу на два моляра и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия еще один-два часа. Заполните форму основания наполовину оптимальной температурой резки, замораживающей средой или OCT.

Избегайте образования пузырей. Захватите край реконструкции щипцами и извлеките реконструкцию из сахарозы. Поместите его на салфетки Кима, пока сахароза не впитается.

С помощью щипцов и шпателя перенесите реконструкцию в лодку поверх ОКТ. Накройте верхнюю часть реконструкции большим количеством ОКТ, пока лодка полностью не заполнится. Опять же, избегая пузырей.

Равномерно положите лодку на толченый сухой лед, чтобы позволить ОКТ полностью замерзнуть. Затем оберните основу формой и фольгой и храните при температуре минус 70 градусов Цельсия, пока не будете готовы разрезать ее криостатом. Чтобы подготовиться к пересадке кожной реконструкции на мыши, заполните емкость жидким азотом и добавьте пять миллилитров DMEM в 50-миллилитровую пробирку.

Наполните стакан 600 миллилитрами водопроводной воды и поставьте стакан на горячую плиту, чтобы он согрелся. Затем выберите самку бесшерстной бесплодной мыши в возрасте около шести недель. После обезболив мышь изофтором.

Используйте носовой конус для поддержания анестезии на протяжении всей процедуры. Нанесите стерильную офтальмологическую смазку и обеспечьте тепловую поддержку для предотвращения переохлаждения. Далее очистите кожу мыши с помощью составной бензоиновой настойки и спиртовых тампонов.

Отметьте линию в верхней части задней части мыши, чтобы сохранить то же положение для последующего наложения швов. Вырежьте круглое раневое ложе на спине мыши с помощью ножниц и щипцов для радужной оболочки глаза, а затем накройте раневое ложе стерильными марлевыми губками. Поместите круглую кожу мыши в 50-миллилитровый тюбик DMEM.

Погрузите пробирку в контейнер с жидким азотом до тех пор, пока все среды и ткани полностью не замерзнут. Далее разморозьте трубку в стакане с горячей водой до полного оттаивания. Повторите это, заморозьте и разморозьте процедуру три раза.

С помощью хирургического лезвия отсоедините кожную реконструкцию от вставки. Очень осторожно снимите мембрану, а затем перенесите восстановленную кожу на верхнюю часть раневого ложа мыши. Теперь поместите скин мыши поверх реконструированной кожи.

Убедитесь, что первый шов находится сверху ранее обозначенного маркера, а второй – снизу. Затем с помощью еще двух швов по бокам кожи реконструируйте, чтобы зафиксировать кожу мыши. Очистите кожу мыши после прививки, а затем поместите мышь в новую клетку.

На 18 день. Эпидермис реконструкций кожи состоит из слоистых слоев кератиноцитов, недифференцированный базальный слой и последовательно дифференцированные слои ориентированы вертикально. Окрашивание участка реконструкций меланоцитарным маркером.

S 100, как указано черными стрелками, показывает, что меланоциты выровнены в базальном слое эпидермиса и сообщаются с несколькими кератиноцитами через дендритные расширения. Дермальный компартмент содержит фибробласты, встроенные в коллаген первого типа, матрикс с отложенным коллагеном четыре указывает на базальную мембрану, которая отделяет эпидермис от дермы. Следующие рисунки иллюстрируют, как развиваются множественные слои кератиноцитов в эпидермисе.

Когда дермальные стволовые клетки, меченные лентивирусным вектором GFP, встраиваются фибробласты. В матриксе коллагена первого типа они мигрируют в эпидермис и дифференцируются в меланоциты на пятый день. После посева кератиноцитов отдельные клетки начинают мигрировать из сфер.

Обратите внимание, что эпидермис по-прежнему состоит из одного слоя. На восьмой день. Несколько клеток достигают границы раздела эпидермиса дермы.

К 10-му дню GFP-положительные клетки плотно выравниваются в положении базальной мембраны, как можно увидеть здесь. Мигрировавшие GFP-положительные клетки в эпидермисе экспрессируют меланоцитарный маркер HMB 45. Когда различные стадии клеточных линий меланомы включаются в реконструкцию кожи, поведение клеток отражает их характеристики in vivo.

Здесь на этом рисунке можно увидеть нормальные меланоциты и клетки меланомы, выращенные в 2D-культурах. Расположение и скорость роста нормальных меланоцитов строго контролируются при реконструкциях кожи, как показано здесь, радиальная фаза роста, первичные меланомы пролиферируют преимущественно в эпидермисе, тогда как меланомы вертикальной фазы роста прорастают инвазивно в дерму, как видно на этом рисунке. Наконец, здесь можно увидеть, как метастатические меланомы агрессивно проникают вглубь дермы.

Наши исследования нормальной кожи закладывают основу для лучшего понимания развития и прогрессирования меланомы.