Трехмерная реконструкция человеческой кожи Модель: инструмент для изучения нормальной кожи и меланомы Прогрессия
3 августа 2011 г.
В этом докладе мы описываем трехмерных кожи реконструировать модель, которая имитирует человеческую кожу в области архитектуры и композиции. Меланоцитов физиологии, меланома прогрессии и судьба кожные стволовые клетки были исследованы с помощью кожи реконструировать модель. Модель также полезны в качестве инструмента для доклинической оценки наркотиков.
Общая цель данной процедуры заключается в создании трехмерной реконструкции человеческой кожи для изучения биологии меланоцитов, меланомы и стволовых клеток кожи. Это достигается путем первоначального покрытия вставки лотка для культивирования тканей нейтрализованным бычьим коллагеном. На втором этапе из фибробластов и коллагена формируется клеточный дермальный компонент.
Затем создайте эпидермальный слой из кератиноцитов, смешанных с меланоцитами или клетками меланомы. Завершающим этапом процедуры является извлечение реконструированной кожи на 18-й день и ее трансплантация мыши. В конечном итоге иммуногистохимический и иммунофлуоресцентный анализы трансплантата демонстрируют архитектуру нормальной кожи, содержащей меланоциты, миграцию и дифференцировку нормальных стволовых клеток, а также стадиеспецифические фенотипы меланомы.
Мы разработали модель реконструкции кожи 20 лет назад, так как на ранних этапах наших исследований обнаружили, что нормальные меланоциты или клетки меланомы, культивируемые в чашке, ведут себя совершенно иначе, чем клетки в контексте ткани. Таким образом, модель реконструкции кожи является для нас идеальным инструментом, позволяющим наблюдать за перемещением клеток из одного слоя кожи в любой другой. Ранее подготовленную бесклеточную смесь коллагена охладите на льду, а затем добавьте 1 mL соломенно-желтого раствора в каждый инсерт шестилуночного планшета.
Инкубируйте лоток для культивирования тканей в лунках в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы гель застыл. В это время, по мере затвердевания геля, цвет раствора должен измениться с желтого на розовый. Трипсинизируйте человеческие фибробласты в культуральном флаконе с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА в течение пяти минут. Добавьте DMEM, содержащий 10% FBS, чтобы нейтрализовать процесс трипсинизации.
Соберите отделившиеся клетки путем центрифугирования в течение пяти минут при 200 G при комнатной температуре, затем ресуспендируйте клетки в концентрации 4.5 × 10⁵ клеток на 1.5 мл DMEM с добавлением 10% FBS. Затем наполните пробирку объемом 50 мл предварительно приготовленной смесью коллагена и клеточного слоя и поместите пробирку на лед.
Добавьте 1,5 milliliters суспензии фибробластов в пробирку и тщательно перемешайте. Добавьте три milliliters раствора соломенно-желтого клеточного слоя в каждый инсерт, покрытый бесклеточным слоем. Затем инкубируйте лоток для культивирования тканей в течение 45 минут при 37 degrees Celsius в инкубаторе для культур тканей с 5% carbon dioxide.
Цвет раствора клеточного слоя также должен измениться с желтого на розовый. После затвердевания верхнего слоя геля добавьте два миллилитра DMEM, содержащего 10% FBS, внутрь вставки в лотке для культивирования тканей и 10 миллилитров — снаружи от вставки. Инкубируйте лотки для культивирования тканей в течение четырех дней.
На четвертый день инкубации, чтобы убедиться в сокращении геля, аспирируйте среду как изнутри, так и снаружи каждого вкладыша. Добавьте 2 мл промывочной среды внутрь и 10 мл снаружи вкладышей, чтобы удалить обычную сыворотку. Затем инкубируйте планшеты в течение одного часа при 37 °C для формирования эпидермиса.
Сначала обработайте кератиноциты человека трипсином. Затем, через пять минут, после центрифугирования отделившихся клеток при 200 G в течение пяти минут, используйте ингибитор трипсина из сои для нейтрализации трипсина. Повторно суспендируйте клеточный осадок в среде для кожи до концентрации 4,17 × 10⁶ клеток/мл.
После сбора кератиноцитов восстановите среду 1. Инкубируйте человеческие меланоциты с трипсином на льду в течение одной-двух минут. Затем снова нейтрализуйте трипсин с помощью соевого ингибитора трипсина.
Затем, после центрифугирования клеток в тех же условиях, что и ранее, ресуспендируйте осадок меланоцитов в среде skin до концентрации 8.3 × 10⁵ клеток/мл. Также восстановите среду medium one. Далее удалите промывочную среду как изнутри, так и снаружи каждого вкладыша в чашке для культивирования тканей с подготовленным дермальным слоем.
Замените промывочную среду, добавив 1,5 миллилитра среды для реконструкции кожи внутрь и 10 миллилитров снаружи каждого вкладыша. Затем смешайте 600 микролитров суспензии кератиноцитов с 600 микролитрами суспензии меланоцитов. Раздайте по 200 микролитров смешанной клеточной суспензии.
Добавляйте по каплям внутрь каждого вкладыша. Инкубируйте лоток для культивирования тканей в течение двух дней при 37 °C. После инкубации клеток аспирируйте среду для реконструкции кожи 1 как изнутри, так и снаружи каждого вкладыша, а затем добавьте 2 мл среды для реконструкции кожи 2 внутрь вкладыша и 10 мл — снаружи.
Затем инкубируйте реконструированные ткани еще в течение двух дней при 37 °C. После второй двухдневной инкубации аспирируйте среду для реконструкции кожи № 2 из внутренней и внешней частей каждого вкладыша. Затем добавьте 7,5 мл среды для реконструкции кожи № 3 только во внешнюю часть вкладышей.
Поместите реконструкты обратно в инкубатор и замените среду. Обновляйте среду для реконструирования каждые два дня до 18-го дня. На 18-й день инкубации аспирируйте среду из внутренней и внешней частей вставок в планшете для культивирования тканей с помещенными в них кожными реконструктами.
Извлеките вставки из кюветы с помощью пинцета. Вырежьте конструкт вместе с поликарбонатным фильтром, описывая скальпелем круг вблизи края. Затем поместите реконструкт на фильтре на твердую поверхность и разрежьте их пополам лезвием скальпеля.
Поместите одну половину реконструированного образца на черный фильтр для биопсии с TBS, затем поместите фильтр в гистологическую кассету. Замочите всю кассету в 10% формалине более чем на четыре часа. После этого перенесите кассету в 70% этанол и храните ее при температуре четырех градусов Цельсия до начала обработки реконструированного образца для заливки в парафин.
Поместите вторую половину реконструированного образца в 50% раствор сахарозы при температуре 4 °C на один-два часа. Затем замените сахарозу на 2 М раствор и снова выдержите образец при 4 °C в течение одного-двух часов. Заполните форму для основания наполовину оптимальной средой для резки и замораживания (OCT).
Следите за тем, чтобы не образовалось пузырьков. Захватите край реконструированного образца пинцетом и извлеките его из раствора сахарозы. Поместите образец на салфетки Kim wipes до полного впитывания сахарозы.
С помощью пинцета и шпателя перенесите реконструкт в кювету поверх OCT. Покройте верхнюю часть реконструкта дополнительным слоем OCT, пока кювета не будет полностью заполнена. Снова следите за тем, чтобы не образовались пузырьки воздуха.
Равномерно поместите лодочку на дробленый сухой лед, чтобы OCT полностью замерз. Затем оберните базовую форму и фольгу и храните при температуре -70 °C до момента разрезания на криостате. Для подготовки к трансплантации реконструированной кожи мыши наполните контейнер жидким азотом и добавьте 5 mL DMEM в пробирку объемом 50 mL.
Наполните стакан 600 миллилитрами водопроводной воды и поместите его на нагревательную плитку для нагрева. Затем выберите самку аутбредной мыши линии skid (безволосой) в возрасте около шести недель. После этого проведите анестезию мыши с помощью изофлурана.
Для поддержания анестезии на протяжении всей процедуры используйте носовую маску. Нанесите стерильный офтальмологический лубрикант и обеспечьте тепловую поддержку для предотвращения гипотермии. Затем очистите кожу мыши с помощью настойки бензоина и спиртовых салфеток.
Отметьте линию на спине мыши, чтобы сохранить исходное положение для последующего наложения швов. С помощью ирисных ножниц и пинцета вырежьте круглый лоскут кожи на спине мыши, после чего накройте раневую поверхность стерильными марлевыми салфетками. Поместите вырезанный круглый фрагмент кожи мыши в пробирку объемом 50 milliliter с DMEM.
Погрузите пробирку в контейнер с жидким азотом до полного замораживания среды и ткани. Затем разморозьте пробирку в стакане с горячей водой до полного оттаивания. Повторите эту процедуру замораживания и оттаивания три раза.
С помощью хирургического скальпеля отделите реконструированный участок кожи от вставки. Очень осторожно удалите мембрану, после чего перенесите реконструированный участок кожи на раневое ложе мыши. Затем накройте реконструированный участок кожи кожей мыши.
Убедитесь, что первый шов наложен поверх ранее отмеченного маркера, а второй — снизу. Затем наложите еще два шва по бокам реконструированного участка, чтобы зафиксировать кожу мыши. Очистите кожу мыши после трансплантации, после чего поместите мышь в новую клетку.
На 18-й день эпидермис реконструированной кожи состоит из многослойных пластов кератиноцитов, при этом недифференцированный базальный слой и последовательно дифференцированные слои ориентированы вертикально. Окрашивание среза реконструированной ткани с использованием меланоцитарного маркера.
S 100, отмеченное черными стрелками, показывает, что меланоциты расположены в базальном слое эпидермиса и взаимодействуют с несколькими кератиноцитами посредством дендритных отростков. Дермальный компонент содержит фибробласты, встроенные в матрикс коллагена I типа; отложенный коллаген IV указывает на базальную мембрану, которая отделяет эпидермис от дермы. На следующих рисунках показано, как формируются несколько слоев кератиноцитов в эпидермисе.
При совместном культивировании с фибробластами дермальные стволовые клетки, меченные лентивирусным вектором GFP, в матриксе из коллагена I типа мигрируют в эпидермис и к пятому дню дифференцируются в меланоциты. После посева кератиноцитов отдельные клетки начинают мигрировать из сфер.
Обратите внимание, что эпидермис по-прежнему состоит из одного слоя. На восьмой день несколько клеток достигают границы раздела эпидермиса и дермы.
К 10-му дню GFP-положительные клетки плотно выстраиваются в области базальной мембраны, что видно здесь. Мигрировавшие в эпидермис GFP-положительные клетки экспрессируют меланоцитарный маркер HMB 45. При включении клеточных линий меланомы на разных стадиях в реконструированные модели кожи поведение клеток отражает их характеристики in vivo.
На данном рисунке представлены нормальные меланоциты и клетки меланомы, выращенные в 2D-культурах. Локализация и скорость роста нормальных меланоцитов в реконструктах кожи строго контролируются, как показано здесь; при радиальной фазе роста первичные меланомы пролиферируют преимущественно в эпидермисе, тогда как меланомы в вертикальной фазе роста инвазивно прорастают в дерму, что видно на этом рисунке. Наконец, здесь продемонстрировано, каким образом метастатические меланомы агрессивно прорастают глубоко в дерму.
Наши исследования нормальной кожи создают основу для более глубокого понимания развития и прогрессирования меланомы.
Обзор
В данном отчете описывается трехмерная модель реконструированной кожи, которая имитирует архитектуру и состав кожи человека. Эта модель использовалась для изучения физиологии меланоцитов, прогрессирования меланомы и судьбы дермальных стволовых клеток, служа ценным доклиническим инструментом для оценки лекарственных препаратов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Онкология
Теоретическая часть
- Модель реконструкции кожи была разработана для более глубокого понимания поведения клеток в контексте ткани.
- Нормальные меланоциты и клетки меланомы ведут себя в культуре иначе, чем in vivo.
- Данная модель позволяет наблюдать за миграцией и дифференцировкой клеток внутри слоев кожи.
- Эта модель разрабатывается более 20 лет, позволяя получать новые сведения о биологии кожи.
Цель исследования
- Для создания трехмерной реконструкции человеческой кожи с целью изучения биологии меланоцитов и меланомы.
- Для исследования взаимодействий между различными типами клеток кожи.
- Для оценки применимости данной модели в доклинических испытаниях лекарственных препаратов.
Используемые методы
- Покрытие планшетов для культивирования тканей нейтрализованным бычьим коллагеном.
- Создание клеточного дермального слоя с использованием фибробластов и коллагена.
- Формирование эпидермального слоя из кератиноцитов, смешанных с меланоцитами или клетками меланомы.
- Проведение иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализа привитых реконструированных образцов кожи.
Основные результаты
- Реконструированная кожа успешно имитировала архитектуру нормальной кожи человека.
- Меланоциты и стволовые клетки продемонстрировали миграцию и дифференцировку внутри модели.
- В реконструированной коже наблюдались фенотипы меланомы, специфичные для конкретных стадий.
- Модель оказалась эффективной для доклинической оценки лекарственных препаратов.
Выводы
- 3D-модель реконструированной кожи является ценным инструментом для изучения биологии кожи.
- Она позволяет получить представление о поведении меланоцитов и прогрессировании меланомы.
- Данная модель может способствовать разработке и тестированию новых терапевтических стратегий.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Трехмерная модель реконструированной кожи человека позволяет проводить прогностические, релевантные для человека исследования биологии меланоцитов и прогрессирования меланомы, преодолевая трансляционные ограничения двухмерных культур и мышиных систем. Данная модель способствует механистическому снижению рисков и валидации мишеней для ранних этапов разработки препаратов в области онкологии и дерматологии. Способность модели воспроизводить естественные межклеточные и матриксные взаимодействия обеспечивает надежную платформу для отбора проектов портфеля и принятия решений на доклиническом этапе.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать гомеостаз меланоцитов и инициацию меланомы в физиологически релевантном контексте.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем моделирования миграции клеток, дифференцировки и прогрессирования опухоли.
- Способствует снижению рисков при изучении механизмов за счет дифференциации стадиеспецифических фенотипов меланомы в тканевой архитектуре, приближенной к человеческой.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированную 3D-систему для количественной оценки поведения клеток и эффектов соединений.
- Обеспечивает воспроизводимое измерение локализации, пролиферации и инвазии клеток в различных экспериментальных условиях.
- Поддерживает стандартизацию анализа для последующего скрининга потенциальных терапевтических средств, направленных на биологию кожи или меланомы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует архитектуре кожи человека при заболеваниях, что повышает достоверность трансляционных исследований по сравнению с мышиными моделями.
- Позволяет оценивать миграцию и дифференцировку стволовых клеток, что способствует поиску и валидации биомаркеров.
- Обеспечивает возможность продвижения кандидатов с учетом рисков путем моделирования метастатического потенциала и взаимодействий в микроокружении опухоли.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эта 3D-модель реконструированной кожи служит связующим звеном между этапами раннего поиска, валидации мишеней и доклинических исследований в программах по изучению кожи и меланомы.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о взаимодействиях между клетками, а также между клетками и матриксом в контексте кожи человека.
- Скрининг: предоставляет количественные, воспроизводимые результаты для оценки соединений и фенотипического скрининга.
- Аналитика: позволяет использовать иммуногистохимический и иммунофлуоресцентный методы анализа для сравнительного изучения состояний клеток и прогрессирования опухоли.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от открытий in vitro к валидации в условиях, приближенных к in vivo, что повышает прогностическую ценность для клинического внедрения.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многократно используемая платформа, адаптируемая к различным типам клеток и моделям заболеваний в рамках портфелей по дерматологии и онкологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях кожи и меланомы.
- Операционная ценность: стандартизирует сложное моделирование тканей, улучшая воспроизводимость и масштабируемость в группах НИОКР.
- Стратегическая ценность: обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), а также распределение капитала, предоставляя данные, релевантные для человека, на ранних этапах разработки.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков и продвижение терапевтических кандидатов, нацеленных на биологию кожи и меланомы.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами клеток, тканевой инженерией и гистологическим анализом.
- Необходим доступ к специализированной инфраструктуре для культивирования тканей и платформам визуализации для проведения конечного анализа.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Метод адаптируем к различным типам клеток и моделям заболеваний, однако для конкретных исследовательских задач может потребоваться оптимизация.
- Ограничения включают необходимость владения техническими навыками создания 3D-культур и возможную вариабельность источников первичных клеток.
