Мультианалитный иммуногранулатический анализ: метод проточного иммуноанализа для одновременного обнаружения нескольких подтипов антител в образце сыворотки крови человека

Мультианалитный иммуношариковый анализ использует несколько микросфер, покрытых антигенами, для одновременного распознавания соответствующих антител-мишеней.

Для начала этого анализа возьмите смесь микрошариков в пробирке, содержащей соответствующий буфер. Каждая бусина покрыта определенным антигеном на своей поверхности, что позволяет легко дифференцировать бусины друг от друга.

Пипеткой нанесите покрытую оболочкой смесь иммуногранул в лунки микротитрового аналитического планшета. Дополните лунки образцом сыворотки, содержащим различные изотипы антител-мишеней. Эти варианты имеют незначительные различия в структуре, что позволяет каждой лунке иметь несколько первичных антител.

Инкубация, позволяющая изотипам антител образца прикрепляться к специфическим антигенам, захваченным на соответствующих иммуногранулах. Промойте пробирным буфером для удаления несвязанных первичных антител. Добавьте в лунку вторичные антитела, меченные флуоресцентным красителем, соответствующие каждому варианту первичного антитела.

Каждое меченое вторичное антитело связывается с Fc-сайтом соответствующего первичного антитела. Множественные захваченные гранулами комплексы антиген-первичные антитела флуоресцентно мечаются. Промойте пластину, чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.

Считывание показаний с планшета с помощью флуоресцентного анализатора, способного одновременно обнаруживать различные флуорофоры на соответствующих длинах волн. В зависимости от обнаружения сигнала можно оценивать различные изотипы сывороточных антител и их связывание с различными антигенами.

Для повышения производительности анализа повторно суспендируйте связанные микросферы вихревым действием на 30 секунд и обрабатывайте ультразвуком в течение 60–90 секунд. Затем удалите необходимое количество коллоида каждого шарика из соответствующей пробирки и соедините коллоиды шариков в новой 1,5-миллиметровой микроцентрифужной пробирке.

Затем вставьте трубку в магнитный сепаратор и дайте отделиться в течение 60 секунд. Пока трубка все еще находится в магнитном сепараторе, удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу гранулы.

После извлечения шариков из сепаратора повторно суспендируйте шарики в 100 микролитрах пробирного буфера. Сделайте вихрь в течение 30 секунд, прежде чем поместить трубку в магнитный сепаратор на 60 секунд, чтобы отделить шарики. Повторите стирку дважды.

Затем отрегулируйте концентрацию трехплексной рабочей микросферной смеси, добавив соответствующий объем буфера для анализа, чтобы получить конечную концентрацию 100 микросфер на 1 мкл для каждой мишени.

Внесите по 25 микролитров микросферной смеси в каждую лунку 96-луночного планшета. Разбавьте образцы плазмы или сыворотки в 500 раз в буфере для анализа и подготовьте стандартные образцы в соответствии с желаемым титрованием.

Добавьте 25 микролитров буфера для анализа в качестве пустого образца и добавьте каждый из разбавленных образцов или стандарта в каждую предназначенную лунку 96-луночного планшета для образцов. Когда закончите, накройте пластину алюминиевым уплотнителем или фольгой для инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре на вибростенде, установленном на 700 оборотов в минуту.

Приготовьте раствор антител против обнаружения человека или вторичных растворов антител в концентрации 4 мкг/мл с буфером для анализа, как описано в рукописи. Поместите пластину на магнитный сепаратор для быстрой промывки, а затем с силой переверните пластину над контейнером биологически опасности, чтобы удалить жидкость из лунок. Не переворачивая тарелку, с силой постучите ее по толстому комку бумаги.

Затем промойте каждую лунку 100 микролитрами буфера для анализа и удалите жидкость путем принудительной инверсии над контейнером для биологически опасных веществ. Повторите стирку дважды. После последней стирки выбросьте все использованные пачки бумаги в контейнер для биологически опасных веществ.

Далее добавьте по 25 микролитров рабочего раствора вторичного антитела в каждую лунку 96-луночного планшета и накройте планшет алюминиевой фольгой для инкубации на вибростенде со скоростью 700 оборотов в минуту.

После 30 минут инкубации дважды промойте лунки планшета пробирным буфером, как было продемонстрировано ранее. Затем добавьте 100 микролитров буфера для анализа в каждую лунку 96-луночного планшета. Накройте тарелку алюминиевой фольгой, и выдержите пять минут в шейкере при комнатной температуре.

Проанализируйте образец объемом 60 микролитров с помощью приборного анализатора в соответствии с инструкцией к системе.