Мультиплексный иммуноферментный анализ на основе шариков для количественного определения нескольких цитокиновых мишеней

Возьмите многолуночную пластину с фильтрами в основании.

Добавьте тестовый образец, содержащий разные цитокины.

Добавьте различные наборы микросфер, дифференцированные по размеру и интенсивности внутренней флуоресценции.

Каждый набор конъюгирован с антителом, нацеленным на определенный цитокин.

Инкубируйте тарелку в темноте при перемешивании.

Антитела связываются со своими цитокинами-мишенями, иммобилизуя их на микросферах.

Примените вакуум для удаления несвязанных цитокинов. Связанные с микросферами цитокины сохраняются благодаря меньшему размеру пор мембраны.

Добавьте коктейль из конъюгированных с биотином детекционных антител, которые связываются с микросферическими цитокинами.

Добавьте флуоресцентный репортер-конъюгированный стрептавидин и инкубируйте в темноте при перемешивании. Стрептавидин связывается с биотином, обездвиживая репортера на микросферном комплексе.

Удалите несвязанные молекулы и снова суспендируйте микросферы.

С помощью проточной цитометрии можно идентифицировать связанные цитокины путем определения размера и внутренней флуоресценции микросфер.

Чтобы определить количество конкретного цитокина, измерьте интенсивность флуоресценции репортера.

Для проведения анализа перед применением дайте всем реагентам нагреться до комнатной температуры.

В этой демонстрации используются полипропиленовые фильтрующие пластины. Крайне важно, чтобы пластина оставалась в вертикальном положении на протяжении всей процедуры анализа, включая этапы промывки, чтобы избежать потери бусин.

Предварительно намочите фильтровальную бумагу, добавив 100 микролитров буфера для промывки 1x в каждую лунку, и дайте пластине постоять 1 минуту при комнатной температуре. Удалите буферный объем с помощью вакуумного коллектора. Промокните излишки буфера для стирки с нижней части тарелки, прижав пластину к стопке чистых бумажных полотенец. Затем поместите тарелку поверх перевернутой крышки тарелки.

Для образцов надосадочной жидкости для клеточных культур добавьте во все лунки по 25 микролитров буфера для анализа. Добавьте по 25 микролитров каждого стандарта в стандартные лунки. Наконец, добавьте по 25 микролитров каждого образца в лунки для образцов. Перемешайте бусины в течение 30 секунд. Затем добавьте по 25 микролитров смешанных шариков в каждую лунку, периодически встряхивая бусину, чтобы избежать оседания бусин.

Запечатайте пластину с помощью пломбировщика. После запечатывания оберните всю пластину, включая перевернутую крышку пластины, алюминиевой фольгой. Поместите тарелку на шейкер для тарелок, закрепите ее и встряхивайте со скоростью примерно 500 об/мин в течение двух часов при комнатной температуре. Не переворачивая, поместите пластину на вакуумный коллектор и подайте вакуум, как и раньше. Затем добавьте 200 микролитров 1x буфера для промывки в каждую лунку.

Удалите содержимое лунок с пробирной пластины методом вакуумной фильтрации. Промокните излишки буфера для стирки с нижней части тарелки впитывающей салфеткой или бумажными полотенцами, прежде чем повторить этот шаг еще раз. Далее добавьте в каждую лунку по 25 микролитров антител для обнаружения. После герметизации пластины свежим запайщиком оберните всю пластину, включая перевернутую крышку пластины, алюминиевой фольгой.

Поместите тарелку на шейкер для тарелок и встряхивайте со скоростью примерно 500 об/мин в течение 1 часа при комнатной температуре. Не вакуумируя, добавьте по 25 микролитров реактива стрептавидина фикоэритрина непосредственно в каждую лунку. Запечатайте и оберните тарелку, как и раньше. Тогда. Поместите тарелку на шейкер для тарелок и встряхивайте со скоростью примерно 500 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре.

Повторив этап вакуумной фильтрации дважды, добавьте по 200 микролитров 1x промывочного буфера в каждую лунку. Подвесьте бусины на шейкер для тарелок на 1 минуту. С помощью многоканальной пипетки перенесите образцы с фильтрующей пластины в пробирки FACS для считывания образцов на проточном цитометре.