Шарик на основе мультиплекс пробирного анализа слезоточивый цитокинового профиля

Общая цель этого протокола заключается в изучении цитокиновых профилей в образцах слезы человека, собранных с помощью полосок Ширмера, с использованием мультиплексного анализа на основе гранул. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области офтальмологии, такие как роль цитокинов при различных глазных заболеваниях. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с ее помощью можно исследовать несколько аналитов в меньших объемах образцов.

Демонстрировать процедуру будет Правин Балн, постдок из моей лаборатории. После сбора слез у испытуемого согласно текстовому протоколу разрежьте полоску слезоточивости на длину 0,5 сантиметра и поместите ее в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 30 микролитров пробирного буфера и инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем центрифугируйте пробирку при 14 000 раз g в течение одной минуты. Переложите надосадочную жидкость в другую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и выбросьте полоску. Затем поместите пробирку с образцом на лед и немедленно используйте образец с элюированием слезы для профилирования цитокинов.

Чтобы провести мультиплексный анализ на основе шариков, доведите все реагенты до комнатной температуры и подвергните их вихревому воздействию в течение 5-10 секунд. Если образцы с элюированием слезы хранились при температуре минус 80 градусов Цельсия до проведения анализа, разморозьте замороженные экстракты слезы на льду и центрифугируйте образцы при 1000 раз больше g в течение пяти минут. Подготовьте лист анализа в вертикальной конфигурации для рабочих стандартов цитокинов человека QC-1, QC-2 и образцов.

Добавьте по 200 микролитров промывочного буфера 1X в каждую лунку пластины и запечатайте ее герметиком для пластин. Затем выдержите тарелку на шейкере при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем сцедите буфер для стирки 1X, перевернув пластину, и несколько раз постучите по абсорбирующему полотенцу, чтобы удалить остатки буфера для стирки в лунках.

Затем добавьте по 25 микролитров каждого рабочего цитокина человека стандарта QC-1, QC-2, бланк с просто пробирным буфером и образцы в соответствующие лунки. Добавьте в каждую лунку по 25 микролитров пробирного буфера. Затем в лунки добавьте 25 микролитров раствора коктейля из бусин 1Х.

Поскольку раствор гранул антитела чувствителен к свету, закройте планшет и накройте его алюминиевой фольгой и крышкой для защиты от света во время анализа. Инкубируйте тарелку при температуре четыре градуса Цельсия в шейкере на ночь. На следующий день поместите пластину на решетку для тарелок автоматической мойки магнитных пластин и дайте ей постоять одну минуту, чтобы магнитные шарики осели на дне лунки.

Отсадите содержимое лунки и добавьте 200 микролитров промывочного буфера на лунку с помощью автоматической магнитной промывочной машины. Дайте тарелке постоять одну минуту, а затем втяните содержимое лунки, как и раньше, и повторите промывку еще раз. Добавьте в каждую лунку по 25 микролитров раствора антител для обнаружения.

Запечатайте пластину. Накройте его алюминиевой фольгой и крышкой тарелки и выдержите при комнатной температуре в шейкере в течение 60 минут. Затем добавьте в каждую лунку по 25 микролитров раствора стрептавидина Фикоэритрина и после запечатывания и накрытия пластины выдержите ее при комнатной температуре в шейкере в течение 30 минут.

После инкубации поместите пластину на магнитную шайбу для пластин и оставьте на одну минуту. Затем отсадите содержимое лунки и добавьте 200 микролитров промывочного буфера на лунку. Дайте ему постоять одну минуту, затем отсасывайте содержимое лунки, прежде чем повторить промывку еще раз.

Добавьте в каждую лунку по 150 микролитров жидкости оболочки. Затем поместите планшет на шейкер на пять минут при комнатной температуре, чтобы повторно суспендировать шарики антител, прежде чем приступить к считыванию показаний планшета и анализу концентраций цитокинов. Чтобы прочитать пробирную пластину в соответствии с текстовым протоколом, откройте страницу партий и нажмите кнопку «Создать новую вкладку партии» из существующего протокола.

В поле Имя партии введите имя партии и введите описание партии в поле ввода необязательного описания. Нажмите на ранее сгенерированный протокол, затем нажмите далее. Следующая вкладка, которая открывается, — это вкладка стандартов и средств контроля.

Ознакомьтесь с подробной информацией о стандартах пробирного анализа и нажмите кнопку Далее. На вкладке «Компоновка пластин» назначьте команды скважины для партии и нажмите кнопку «Сохранить», чтобы сохранить информацию о партии в списке ожидающих партий. Загрузите пластину в считыватель мультиплексных пробирных пластин на основе валиков и запустите партию из списка ожидающих партий.

Запустите программное обеспечение для преобразования RBX и в разделе «Выберите файлы экспоненты» выберите файл csv, созданный с помощью программного обеспечения для мультиплексного анализа на основе гранул. Затем нажмите на кнопку «Создать». Файл rbx будет сохранен в выбранной выходной папке.

Теперь запустите программное обеспечение для анализа и откройте файл rbx. Затем с помощью подгонки кривой 4PL-5PL оптимизируйте стандартные кривые. Чтобы оптимизировать стандартные кривые, выберите следующие параметры на вкладке стандартной кривой: тип регрессии, логистика 5PL и получите доступ к журналу преобразования X, линейный Y. Затем отметьте следующие поля, покажите линии диапазона концентрации, покажите неизвестные образцы, покажите контрольные образцы, примените ко всем аналитам и отобразите отчет после оптимизации.

Нажмите кнопку оптимизации для автоматической оптимизации. На вкладке ввода сведений об образце пометьте образцы удостоверений. Наконец, получите наблюдаемые концентрации на вкладке таблицы отчета и нажмите на «Экспорт таблицы отчета», чтобы сгенерировать данные в файле электронной таблицы для дальнейшего анализа.

Образцы слез были собраны из восьми глаз четырех здоровых мужчин в возрасте от 36 до 52 лет. Из 41 цитокина, проанализированного с помощью мультиплексного анализа на основе гранул, 31 был обнаружен во всех образцах слезы. Например, ИЛ-17А, MIP-1b и TNFa были обнаружены в семи глазах четырех испытуемых, а ИЛ-4 был обнаружен в шести глазах четырех испытуемых.

Кроме того, интерферон гамма был обнаружен в шести глазах трех испытуемых. Интерлейкин-1а был обнаружен в пяти глазах трех испытуемых. Эотаксин и интерлейкин-9 были обнаружены в трех глазах двух испытуемых.

Интерлейкин-3 был обнаружен в одном глазу, а MIP-1a не был обнаружен ни в одном из образцов. Средние плюс-минус стандартные отклонения концентраций 41 обнаруженного цитокина показаны на этой диаграмме рассеяния. Интерлейкин-1ra был высоко экспрессирован во всех образцах.

Цитокины IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, Fractalkine, Interleukin-a, EGF, PDGF-BB, VEGF и G-CSF также были высоко экспрессированы на уровнях нанограмм на миллилитр, а остальные цитокины были экспрессированы на уровнях пикограмм на миллилитр. Как видно на рисунке, самая низкая измеренная концентрация цитокина слезы была TNF-a со средним плюс-минус стандартным отклонением 27,25 плюс-минус 19,97 пикограмм на миллилитр. В 31 цитокине, которые были обнаружены во всех образцах, ни один из них не показал статистически значимой разницы в концентрации между правым и левым глазом по тесту Т.

После освоения этой техники ее можно сделать за 1-1/2 дня, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить мультиплексный анализ на основе гранул для профилирования слезных цитокинов.