Электрохемилюминесцентный анализ для количественного определения целевых уровней белка в лизате мозга

Для количественного определения специфического белка в лизате мозга мыши с помощью электрохемилюминесценции, ЭКЛ, иммуноферментного анализа начинают с многолуночного аналограммного планшета.

Скважины состоят из токоведущих рабочих и противоэлектродов, замыкающих электрическую цепь. Диэлектрический слой разделяет электроды, повышая чувствительность анализа.

Добавьте в лунки первичные мышиные моноклональные антитела против целевого белка. Рабочие электроды, обладая большей связывающей способностью, облегчают иммобилизацию антител на них.

Инкубировать с белоксодержащим раствором, связываясь с оставшимися связующими поверхностями лунки, уменьшая фоновую интерференцию.

Добавьте лизат ядерной фракции мозга мыши. Целевой белок в лизате специфически связывается с моноклональными антителами.

Добавьте немеченые поликлональные антитела, узнавающие и связывающиеся с эпитопами на белке, который связывается с первичными моноклональными антителами на электроде. Добавьте специфические вторичные антитела, меченные комплексом рутения, связывающиеся с немечеными антителами. Добавьте подходящий буфер, содержащий поверхностно-активное вещество, обеспечивающее подходящую среду для генерации ECL, и трипропиламин, TPA.

Поместите многолуночный планшет в систему обнаружения ECL. При приложении потенциала к электродам рутениевый комплекс, связанный с антителами, окисляется. В то же время ТФА окисляется и спонтанно теряет протон.

Образующийся радикал ТФК восстанавливает окисленный рутениевый комплекс до возбужденного состояния. При релаксации до основного состояния рутениевый комплекс испускает фотон, обнаруженный фотодетектором.

Измеренная интенсивность света является репрезентативной для удельной концентрации белка лизата.

Достаньте из холодильника пластину на 96 лунок и снимите фольгу. Удалите раствор для покрытия антител из лунок, бросив его в контейнер для отходов. Затем постучите тарелкой по бумажному полотенцу, чтобы удалить остатки раствора.

Далее в каждую лунку добавьте по 125 микролитров блокирующего раствора. Затем снова запечатайте пластину клейкой фольгой. Поместите планшет на орбитальный шейкер для микропланшетов, установленный на 800 об/мин, и инкубируйте его в течение 90 минут при комнатной температуре.

Разморозьте на льду один флакон исходного раствора белка MeCP2 или TAT-MeCP2, лизаты мозга мыши и лизаты HDF. Развести белковый исходный раствор в чистых пробирках, как описано в таблице 2 рукописи.

Далее разведите образцы лизата. Для лизатов мозга мыши используйте от 1 до 20 микрограммов на 25 микролитров буфера для лизиса. Для лизата HDF добавьте от 0,25 до 1 микрограмма на 25 микролитров буфера для лизиса.

После инкубации 96-луночного планшета в течение 90 минут удалите блокирующий раствор из лунок, бросив его в контейнер для отходов. Затем постучите тарелкой по бумажному полотенцу, чтобы удалить остатки раствора. Затем вымойте тарелку 3 раза со 150 микролитрами моющего раствора, добавив моющий раствор и сразу же удалив его.

Добавьте 25 микролитров стандартов и проб в лунки 96-луночного планшета. Закройте планшет и инкубируйте его еще четыре часа при комнатной температуре, постоянно встряхивая со скоростью 800 об/мин.

Разморозьте на льду немеченое антитело для обнаружения, поликлональное антитело кролика к MeCP2. Используя раствор разбавителя анализа, разведите антитело в соотношении 1:6000. Когда планшет на 96 лунок завершит инкубацию в шейкере, удалите стандарты и образцы, бросив планшет в контейнер для отходов. Затем постучите тарелкой по бумажному полотенцу, чтобы удалить остатки раствора.

Вымойте тарелку 3 раза со 150 микролитрами моющего раствора, добавив моющий раствор, и сразу же убрав его. Добавьте 25 микролитров немеченого раствора антител для обнаружения в каждую лунку с помощью многоканального дозеттера. Укупорьте пластину и выдержите ее в течение 1 часа при комнатной температуре с постоянным встряхиванием при 800 об/мин.

Достаньте специфическое вторичное антитело из холодильника и положите его на лед. Разведите вторичное антитело в растворе разбавителя и аккуратно перемешайте.

Чтобы удалить немаркированное антитело с 96-луночного планшета, бросьте его в контейнер для отходов, а затем постучите пластиной по бумажному полотенцу. Промыв пластину 3 раза, как описано ранее, добавьте по 25 микролитров вторичного антитела в каждую лунку с помощью многоканального пипеттора. Укупорьте пластину и выдержите ее в течение 1 часа при комнатной температуре с постоянным встряхиванием при 800 об/мин.

Удалите свободное вторичное антитело, бросив его в контейнер для отходов и постучав пластиной по бумажному полотенцу, а затем промойте пластину три раза, как описано ранее.

В каждую лунку планшета добавьте 150 микролитров 1X трис-based Gold reading buffer с поверхностно-активным веществом, содержащим трипропиламин в качестве сореагента для генерации света.

Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, используйте методы обратного пипетирования. Поместите 96-луночный планшет на микропланшетную платформу с системой детектирования электрохемилюминесценции.

Используя встроенную ПЗС-камеру, немедленно приступайте к захвату данных. Запишите количество сигналов, которые соответствуют относительным единицам измерения освещенности и прямо пропорциональны интенсивности света.