Выделение Т-клеток на основе флотации с использованием сортировки клеток, активируемых плавучестью

Чтобы изолировать Т-клетки — белые кровяные клетки, необходимые для иммунной системы — с помощью сортировки клеток, активируемых плавучестью, BACS, берут суспензию мононуклеарных клеток периферической крови, PBMCs. PBMC содержат целевые Т-клетки и нецелевые клетки, такие как В-клетки, моноциты, естественные киллеры и дендритные клетки.

Добавьте буфер, содержащий достаточное количество биотинилированных анти-CD3 антител, и инкубируйте в течение необходимого времени. Антитело связывается с комплексом CD3 — мультимерным белковым комплексом на поверхности клетки, что является определяющей особенностью Т-клеток.

Добавьте функционализированные микропузырьки — мелкие сферические частицы, покрытые стрептавидином — для положительного отбора Т-клеток, связанных с антителами. Ядро каждого микропузырька представляет собой полую сферу, что делает их частицами низкой плотности, способными плавать в водном растворе.

Инкубируйте смесь при перемешивании, давая микропузырькам и образцу тщательно перемешаться. Во время инкубации стрептавидин на микропузырьках связывается с биотином на Т-клеточном антителе, иммобилизуя клетки на микропузырьках.

Центрифугируйте пробирку. Нецелевые ячейки отделяются от смеси в виде гранул на дне.

Микропузырьки, связанные с Т-клетками, остаются на плаву на поверхности, что приводит к разделению Т-клеток, основанному на плавучести. Этот метод разделения ограничивает нагрузку на клетки-мишени. С помощью тонкой пипетки удалите гранулу и надосадочную жидкость, не нарушая слой микропузырьков.

Ресуспендируйте изолированные, связанные с микропузырьками Т-клетки в подходящей питательной среде для дальнейшей обработки.

Для начала инкубируйте 3 x 10⁸ коммерчески полученных PBMC в 2,5 мл разделительного буфера с биотинилированными анти-CD3 антителами. Аккуратно перемешайте компоненты с помощью пипетирования, и выдержите их при комнатной температуре в течение 10 минут.

Добавьте микропузырьки стрептавидина в ячейки в соотношении 0,5 к 1, в соответствии с инструкциями производителя, и перемешайте с помощью коммерческого ротатора «конец за концом» со скоростью 20 об/мин в течение 10-15 минут при комнатной температуре. Центрифуга при плотности 400 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.

После центрифугирования положительно отобранные клетки будут находиться в верхней части суспензии с микропузырьками стрептавидина, а оставшиеся неотобранные клетки будут находиться в клеточной грануле на дне пробирки.

С помощью 9-дюймовой стеклянной пипетки вставьте наконечник ниже слоя пузырьковых клеток на дно пробирки. Аспирируйте клеточную гранулу и надосадочную жидкость с помощью электронной пипетки и перенесите их в новую пробирку.

Ресуспендируйте слой пузырьковых клеток, оставшийся в исходной пробирке, в 1 миллилитр полной Т-клеточной среды. Центрифугируйте надосадочную жидкость при плотности 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и используйте ее для косвенного измерения чистоты и восстановления.