Выделение маргинирующих лейкоцитов печени из печени мыши

Маргинирующие печеночные, МН, лейкоциты, обнаруживаются прикрепленными к стенкам специализированных кровеносных сосудов печени или синусоид, которые выстланы эндотелиальными клетками. Лейкоциты MH рекрутируются в окружающие ткани в ответ на воспаление.

Чтобы собрать лейкоциты MH, начните с усыпленной мыши в лежачем положении. Надрезают брюшную и грудную полости, обнажая печень и сердечно-легочный комплекс.

Сместите кишечник, чтобы обнажить воротную вену, которая несет кровь от селезенки, желудочно-кишечного тракта и связанных с ним органов к печени. Введите в воротную вену иглу, соединенную с перистальтическим насосом.

Рассеките нижнюю полую вену — крупный кровеносный сосуд, несущий дезоксигенированную кровь от печени к сердцу — чтобы собрать перфузат во время перфузии.

Перфузируйте печень через воротную вену буфером, содержащим антикоагулянт, с низкой скоростью потока в течение короткого времени. Этот этап помогает удалить кровь с неадгезивными клетками из кровеносных сосудов печени через отток нижней полой вены. Выбросьте этот зараженный кровью перфузат.

Теперь перфузируйте с более высокой скоростью потока. Принудительная перфузия с увеличенным потоком и скоростью сдвига нарушает адгезию между лейкоцитами MH и внутренней оболочкой кровеносных сосудов, тем самым отделяя лейкоциты MH от синусоидальной стенки.

Соберите и перенесите перфузат, содержащий лейкоциты MH и другие клетки крови, в свежую пробирку. Центрифуга. Повторно суспендируйте гранулы, содержащие лейкоциты MH, для дальнейшего анализа.

Для сбора мышиных маргинально-печеночных лейкоцитов, сразу после прекращения дыхания, с помощью стерильных ножниц и щипцов из зубной ткани делают срединный разрез брюшной полости вплоть до мечевидного отростка. Далее с помощью щипцов приподнимают грудину и аккуратно разрезают диафрагму и грудную клетку с обеих сторон.

Зажмите кровоостанавливающее средство на грудине и сложите грудную клетку рострально, чтобы обнажить сердечно-легочный комплекс. Выведите кишечник за пределы брюшной полости влево от животного, обнажив воротную вену. Затем подключите иглу 30-го калибра к перистальтическому насосу и вставьте ее в воротную вену, рострально к селезеночной вене.

Разрежьте нижнюю полую вену над диафрагмой, чтобы обеспечить дренаж и сбор перфузата из грудной полости. Затем включите перистальтический насос со скоростью примерно 3 миллилитра в минуту и соберите первые миллилитры зараженного кровью перфузата из бассейна грудной полости. Когда будет собрано 3 миллилитра, выключите насос.

Затем, после введения иглы-бабочки 21-го калибра, подключенной к 10-миллилитровому шприцу, повторно инициируют перфузию со скоростью до 4 миллилитров в минуту до тех пор, пока из грудной полости не будет собрано 10 миллилитров перфузата. Когда печень станет светло-коричневой, прекратите перфузию. Далее переложите перфузат в 15-миллилитровую трубку. Центрифугируйте его, а затем аспирируйте надосадочную жидкость.