Сывороточный бактерицидный анализ на комплемент-опосредованную бактерицидную активность антител

Возьмите серийно разведенный образец сыворотки, содержащий моноклональные антитела против липополисахаридов, или ЛПС — компонента внешней мембраны грамотрицательных бактерий.

Вводите грамотрицательные бактерии. Сывороточные антитела связываются с бактериальным ЛПС.

Добавьте белки комплемента. Комплекс С1 связывается с ЛПС-связанными антителами, образуя ферментативно активный С1.

Активированный С1 расщепляет С4 и С2 с образованием С3-конвертазы, которая расщепляет С3 с образованием С5-конвертазы. Конвертаза расщепляет C5 с образованием C5b, который рекрутирует C6 и C7. Полученный комплекс встраивается в наружную оболочку и связывается с С8 и кратным С9, образуя пору.

Повреждение внешней мембраны дестабилизирует внутреннюю мембрану, вызывая лизис клеток.

Выложите смесь на агаровую пластину и выложите. Инкубируйте для роста бактерий. Нанесите на пластину агар, содержащий трифенилтетразолия хлорид, или ТТК, который восстанавливается микробными дегидрогеназами, придавая колонии бактерий красный цвет.

Количество колоний увеличивается при разведении образца, что указывает на снижение бактерицидной активности при более низкой концентрации антител.

Для начала инкубируйте образцы на теплой водяной бане при температуре 56 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы нагреть испытуемые образцы. Получите пластину для анализа и 20 микролитров буфера для анализа в столбцы с 1 по 12 строк от A до G. Добавьте 20 микролитров буфера для анализа в столбцы 1 и 2 строки H. Загрузите по 30 микролитров каждого образца в двух экземплярах в ряд H пластины для анализа.

Чтобы начать выполнять трехкратное последовательное разведение исследуемых образцов, используйте многоканальную пипетку для удаления 10 микролитров из лунок с 3H по 12H. Перенесите образцы в соответствующие лунки в ряду G и пипеткой вверх и вниз от 8 до 10 раз, чтобы хорошо перемешать образец. Затем удалите 10 микролитров из этих лунок, переложите в соответствующие лунки в ряду F и пипеткой вверх и вниз от 8 до 10 раз перемешайте. Продолжайте этот процесс последовательного разведения в строке А. После смешивания лунок в ряду А удалите и отбросьте 10 микролитров из лунок с 3А по 12А так, чтобы конечный объем во всех лунках составил 20 микролитров.

Достаньте один флакон замороженного целевого бактериального запаса и разморозьте его при комнатной температуре. Затем разведите бактерии в 20 мл буфера для анализа в соответствии с заданным оптимальным коэффициентом разведения. С помощью многоканальной пипетки добавьте по 10 микролитров разведенных бактерий в каждую лунку пробирной пластины.

Достаньте один флакон замороженного крольчатого комплемента и один флакон замороженного BRC, инактивированного при нагревании. Используйте холодную проточную воду, чтобы разморозить флаконы до комнатной температуры. Затем смешайте 100 микролитров теплового и инактивированного при нагревании BRC с 400 микролитрами буфера для анализа. Добавьте 50 микролитров этого 20% инактивированного теплом раствора BRC во все лунки в столбце 1. Смешайте 1 миллилитр нативного BRC с 4 миллилитрами буфера для анализа. Добавьте 50 микролитров этой 20% смеси во все лунки в столбцах со 2 по 12. Поместите пластину на шейкер на 10-15 секунд, чтобы аккуратно перемешать пластину для анализа.

Инкубируйте пробирный планшет в микробиологическом инкубаторе в течение двух часов. Тем временем снимите крышки с двух агаровых пластин LB и поместите пластины лицевой стороной вверх в шкаф биологической безопасности на 40-60 минут для высыхания. Когда инкубация будет завершена, переложите планшет для анализа на влажный лед и инкубируйте в течение 10-20 минут, чтобы остановить реакцию. С помощью 12-канальной пипетки смешайте лунки в ряду H и нанесите 10 микролитров реакционной смеси на дно пластины LBA. Сразу же наклоните пластину, и дайте пятнам пробежаться примерно на 1,5 – 2 сантиметра.

Повторите эту процедуру для рядов G, F и E, расположив их выше предыдущего ряда. Инкубируйте планшеты LBA при комнатной температуре, пока раствор не впитается в планшеты LBA. Затем накройте пластины крышками, и перенесите их вверх дном в микробиологический инкубатор для инкубации в течение ночи.

На следующий день добавьте 25 мл наложенного агара при температуре 55 градусов Цельсия, содержащего 100 микрограммов на миллилитр TTC и 0,1% азида натрия, в каждую пластину LBA. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов, чтобы выжившие бактерии приобрели красный цвет. Затем используйте цифровую камеру, чтобы сфотографировать пластины. Перенесите изображения на компьютер и используйте интегрированное программное обеспечение для перечисления колоний NIST для анализа изображений в соответствии с текстовым протоколом.