Методы количественного определения антител-индуцированной активации комплемента по ЭРИТРОЦИТОВ
29 января 2014 г.
Здесь мы опишем два анализы для измерения активации комплемента, вызванное антителами против красных кровяных клеток. Основным преимуществом над текущими анализов является их количественный и природа простой в интерпретации.
Общая цель следующего эксперимента заключается в оценке активации комплемента антителами против эритроцитов (RBC) в сыворотке пациента. Это достигается путем инкубации эритроцитов с сывороткой пациента в присутствии блокирующих антител к C5 для индукции отложения C4 и C3 на поверхности эритроцитов. Затем эритроциты окрашивают флуоресцентно меченными антителами к C4 и C3, после чего количество отложений комплемента на эритроцитах можно проанализировать с помощью проточной цитометрии в рамках альтернативного метода.
Эритроциты инкубируют с сывороткой пациента в отсутствие анти-C5 для индукции комплемент-зависимого лизиса. Процент лизированных эритроцитов затем определяют с помощью спектрометрии, измеряя количество гемоглобина, высвобожденного клетками. Основным преимуществом этого нового метода по сравнению с существующими, такими как тест на гемолиз или антиглобулиновый тест, используемыми в рутинной диагностике, является его количественный характер, что позволяет выявлять незначительные различия в активации комплемента.
Элизабет Брук, постдок в нашей лаборатории, продемонстрирует соответствующие процедуры. Начните с трехкратной промывки эритроцитов группы 0 с помощью PBS, затем инкубируйте осадок в 0,5% растворе Roma lane в соотношении 1:2 в течение 10 минут при 37 °C. После еще трехкратной промывки клеток храните их в виде 3% раствора в свежем PBS при 4 °C для анализа отложения комплемента на эритроцитах методом проточной цитометрии. Сначала проведите термоинактивацию необходимого количества сыворотки пациента в течение 30 минут при 56 °C. Пока сыворотка проходит термическую обработку, промойте обработанные раствором brola эритроциты трижды в буфере Roal после финальной промывки.
Ресуспендируйте осадок в vbg plus plus в разведении 0,5%. Затем, используя стеклянный шарик, добавьте в каждую лунку 96-луночного планшета с круглым дном 25 µL 0,5% RBCs, 37,5 µL свежей сыворотки AB и 37,5 µL анти-C5 в концентрации 200 µg/mL.
Используйте VBG plus plus, чтобы довести конечный объем в каждой лунке до 150 µL, затем инкубируйте планшет, накрытый фольгой для EIA, от полутора до двух часов при 37 °C с перемешиванием. После инкубации трижды промойте клетки буфером PBS с добавлением 0,5% BSA, а затем проведите маркировку клеток, используя флуоресцентно меченные моноклональные антитела к C3 и C4 в концентрации 1 µg/mL. Инкубируйте клетки в течение 30–45 минут при комнатной температуре при осторожном перемешивании, после чего трижды промойте планшет и ресуспендируйте эритроциты в 150 µL PBS с 0,5% BSA на лунку.
Перенесите клеточные суспензии в новый 96-луночный планшет с круглым дном, затем установите планшет в проточный цитофлуориметр и отделите одиночные клетки от дуплетов с помощью графика прямого светорассеяния. Установите гейт на одиночные эритроциты, после чего выберите соответствующий канал детектирования для флуоресцентных сигналов. Для количественного анализа гемолиза определите результаты, используя медианную интенсивность флуоресценции; нагрейте и активируйте сыворотку пациента, а затем промойте обработанные ромеином эритроциты, как было показано ранее.
Затем после инкубации эритроцитов с комплементом и сывороткой пациента, как было продемонстрировано выше, но без добавления анти-C5, центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 664 ×g с пониженным торможением. Затем осторожно перенесите 90 µL супернатанта в новый микротитрационный планшет, стараясь не переносить целые клетки и избегая образования пузырьков воздуха, и измерьте абсорбцию при 414–690 нм на спектрофотометре. Выразите гемолиз в процентах от лизиса образца эритроцитов, инкубированных в дистиллированной воде.
На этом первом рисунке представлены репрезентативные диаграммы рассеяния для эритроцитов, обработанных brola; здесь показано подходящее гейтирование для одиночных эритроцитов. Обычно около 95% эритроцитов попадают в этот гейт одиночных клеток. На данных гистограммах представлены репрезентативные результаты влияния аутоиммунной гемолитической анемии (АИГА).
Осаждение C4 и C3 при использовании сыворотки пациента показано в соответствии с ожиданиями: большее количество сыворотки пациента приводит к более выраженному осаждению комплемента. Примечательно, что осаждение комплемента проявляется в виде двух отдельных положительных пиков. Вероятно, это не вызвано гетерогенностью популяции эритроцитов, так как эритроциты получены от одного донора, хотя причина данного явления все еще исследуется; медианная интенсивность флуоресценции образцов представлена на этих линейных графиках для демонстрации воспроизводимости анализов на осаждение C4 и C3.
Обратите внимание на значительные различия в уровне осаждения различных образцов пациентов с AH H. Наконец, на этих графиках можно увидеть данные гемолитического анализа образца сыворотки пациента с ahha, содержащего аутоантитела к эритроцитам. Титрование с использованием образца сыворотки дает четкую воспроизводимую кривую при применении подходящего ингибитора комплемента, такого как anti C five.
Гемолитический сигнал может быть титрован, как показано на данном графике. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять активацию комплемента с помощью антител, специфичных к эритроцитам, либо путем проточной цитометрии для анализа депозиции C3 или C4, либо с помощью количественного гемолитического анализа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описаны два метода анализа для измерения активации комплемента, индуцированной антителами к эритроцитам. Эти анализы являются количественными и легко интерпретируемыми, что дает им преимущества перед существующими методами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Гематология
- Проточная цитометрия
Теоретические основы
- Активация комплемента играет ключевую роль в иммунных ответах.
- Антитела к эритроцитам могут приводить к различным клиническим состояниям.
- Современные методы анализа могут не обладать достаточной количественной точностью.
- Новые методы направлены на улучшение детекции активации комплемента.
Цель исследования
- Оценить активацию комплемента антителами к эритроцитам.
- Разработать количественный анализ для более точной интерпретации результатов.
- Сравнить новые методики с существующими диагностическими методами.
Используемые методы
- Инкубация эритроцитов с сывороткой пациента и блокирующими антителами.
- Окрашивание эритроцитов антителами с флуоресцентной меткой.
- Анализ осаждения комплемента методом проточной цитометрии.
- Измерение высвобождения гемоглобина для определения лизиса эритроцитов.
Основные результаты
- Новые методы анализа позволяют получать количественные данные об активации комплемента.
- Возможно обнаружение даже незначительных различий в степени активации.
- Результаты демонстрируют повышенную чувствительность по сравнению с традиционными методами.
- Анализ методом проточной цитометрии обеспечивает возможность детальной интерпретации.
Выводы
- Новые методы анализа углубляют понимание механизмов активации комплемента.
- Они представляют собой надежную альтернативу существующим диагностическим тестам.
- Дальнейшее применение данных методов может улучшить диагностику и лечение пациентов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественная оценка антитело-индуцированной активации комплемента на эритроцитах имеет решающее значение для оценки эффективности ингибиторов комплемента и понимания механизмов гемолиза при аутоиммунных и аллоиммунных заболеваниях. Описанные методы проточной цитометрии и спектрофотометрического анализа обеспечивают воспроизводимые количественные результаты, позволяющие выявлять незначительные различия в активации комплемента, что способствует снижению механистических рисков при разработке терапевтических средств. Данные методы повышают достоверность прогнозов при валидации мишеней, переводя качественные наблюдения в измеримые, транслируемые биомаркеры для принятия решений на доклиническом и клиническом этапах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения депозиции комплемента (C3/C4) на эритроцитах, индуцированной аутоантителами или аллоантителами.
- Операционная ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишени посредством прямого измерения эффекторной активности, опосредованной антителами, что снижает механистическую неопределенность при выборе мишени.
- Прогностическая ценность: способствует сортировке портфеля препаратов за счет получения количественных данных о силе активации комплемента, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) терапевтических средств, модулирующих систему комплемента.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Позволяет получать стандартизированные количественные результаты (медианная интенсивность флуоресценции, высвобождение гемоглобина), подходящие для высокопроизводительного скрининга ингибиторов комплемента или терапевтических антител.
- Воспроизводимость: Демонстрирует низкую вариабельность между образцами сыворотки пациентов, что обеспечивает надежную оценку соединений и межлабораторную стандартизацию.
- Полезность платформы: Использует доступное оборудование (проточный цитометр, спектрофотометр) для создания многократно используемых методов измерения комплемент-зависимой биоактивности в процессах поиска новых лекарственных средств.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует патофизиологические механизмы при аутоиммунной гемолитической анемии (AIHA) и аллоиммунном гемолизе, связывая взаимодействие с мишенью с функциональной активацией комплемента.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает переход от этапа поиска к доклинической валидации, предоставляя количественные биомаркеры (отложение C3/C4, гемолиз), которые коррелируют с клиническим гемолитическим потенциалом.
- Снижение рисков при разработке: Позволяет снизить механистические риски путем количественной оценки комплемент-опосредованного лизиса, что служит основой для оценки безопасности и моделирования зависимости «доза-эффект» в доклинических исследованиях.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данные анализы интегрируются в общий цикл разработки — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки безопасности, предоставляя количественные показатели активации комплемента, которые позволяют снизить биологические риски и оценить терапевтический индекс.
- Биологические исследования: способствует проверке гипотез путем количественного определения путей активации комплемента, индуцированных антителами, что позволяет прояснить механизм действия иммуномодулирующих препаратов-кандидатов.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных результатов, готовых для анализа (интенсивность флуоресценции, спектрофотометрический гемолиз), что позволяет проводить надежное сравнение тестируемых соединений или образцов сыворотки.
- Аналитика: генерирует измеримые показатели (медианная интенсивность флуоресценции, высвобождение гемоглобина), которые облегчают статистический анализ и сравнение условий в исследованиях зависимости «доза-эффект».
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническим этапом благодаря получению результатов, имеющих значение для патологии и отражающих активацию комплемента, наблюдаемую при АИГКБ и при переливании крови.
- Корпоративное использование: создает масштабируемую стандартизированную платформу для оценки комплемент-зависимой активности различных терапевтических антител, биоаналогов и ингибиторов комплемента.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при валидации мишени за счет преобразования качественных анализов комплемента в количественные, интерпретируемые показатели.
- Практическая ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря четко определенным протоколам подготовки эритроцитов, инкубации сыворотки и детекции методом проточной цитометрии или спектрометрии.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах выявлять риски активации комплемента, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях реализации программ иммуномодуляции.
- Влияние на портфель: Обосновывает приоритизацию с учетом рисков путем количественной оценки потенциала активации комплемента, что способствует принятию объективных решений о дальнейшем продвижении в разработке терапевтических средств.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области иммунологии, проточной цитометрии и проведения спектрофотометрического анализа для точного измерения депозиции комплемента и гемолиза.
- Необходим доступ к проточным цитометрам с соответствующими каналами флуоресценции и спектрофотометрам для количественного определения гемоглобина при 414/690 nm.
- Необходима стандартизация подготовки эритроцитов (например, нулевого типа, обработанных бромелином) и тепловой инактивации сыворотки для обеспечения согласованности результатов анализа у разных пользователей и в разных лабораториях.
- При применении метода к эритроцитам других видов, с иной плотностью антигенов или при использовании источников комплемента, отличных от сыворотки группы AB человека, требуются соответствующие корректировки.
- Практические ограничения включают необходимость осторожного переноса супернатанта во избежание попадания клеток и образования пузырьков воздуха, что может повлиять на точность количественной оценки гемолиза.
