Методы количественного определения антител-индуцированной активации комплемента по ЭРИТРОЦИТОВ

Общей целью данного эксперимента является оценка активации комплемента антителами против эритроцитов или эритроцитов в сыворотке крови пациента. Это достигается путем инкубации эритроцитов с сывороткой крови пациента в присутствии блокирующих антител к С-5 для индуцирования отложения С-4 и С3 на поверхности эритроцитов. Затем эритроциты окрашивают флуоресцентно мечеными антителами против С-4 и анти-С3, а количество отложений комплемента на эритроцитах затем можно проанализировать с помощью проточной цитометрии альтернативным методом.

Эритроциты инкубируются с сывороткой крови пациента в отсутствие анти-С-5 для индуцирования опосредованного комплементом лизиса. Процент лизированных эритроцитов может быть затем определен путем измерения количества гемоглобина, выделяемого клетками с помощью спектрометрии. Основное преимущество этой новой методики перед существующими методами, такими как гемолиз или тест на антиглобулины, используемые в рутинной диагностике, заключается в том, что она носит количественный характер, и мы можем обнаружить неоптимальные различия в активации комплемента.

Элизабет Брук, постдок в нашей лаборатории, продемонстрирует следующие процедуры: начните с трехкратной промывки эритроцитов нулевого типа с помощью PBS, затем инкубируйте гранулу в 0,5% растворе Roma lane в соотношении один к двум в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия после еще трех промывки клеток, храните их в виде 3%-ного раствора в свежем PBS при четырех градусах Цельсия для анализа отложения комплемента на эритроцитах с помощью проточной цитометрии. Сначала при нагревании нужного количества сыворотки пациента в течение 30 минут при температуре 56 градусов Цельсия, пока сыворотка подвергается термической обработке. Промыть обработанные эритроцитарные тельца в буфере Roal после окончательного промывки.

Ресуспендируйте гранулу в vbg plus plus в разведении 0,5%. Далее в стакан жемчуга 25 микролитров 0,5% эритроцитов, 37,5 микролитров свежей сыворотки АВ и 37,5 микролитров 200 микрограмм на миллилитр, анти С по пять в каждую лунку 96 лунки круглой нижней пластины. Затем добавьте инактивированную при нагревании сыворотку пациента в каждую лунку в соответствующей концентрации, дополняя ее термоинактивированной сывороткой AB по мере необходимости, а также с отрицательным контролем.

С помощью VBG plus plus доведите каждую лунку до конечного объема в 150 микролитров, а затем инкубируйте тарелку, покрытую фольгой E IA, в течение полутора-двух часов при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием после инкубации. Промойте клетки три раза PBS с добавлением 0,5% BSA, а затем пометьте клетки одним микрограммом на миллилитр. Флуоресцентно меченые анти С3 и анти С четыре моноклональных антитела инкубируют клетки в течение от 30 до 45 минут при комнатной температуре с легким встряхиванием, а затем, промыв планшет три раза, ресуспендируют эритроциты в 150 микролитрах PBS плюс 0,5% BSA на пер.

Хорошо перенесите клеточные суспензии на новую 96-луночную круглую нижнюю пластину, а затем загрузите пластину на проточный цитометр, отделите одиночные клетки от дублетов с помощью диаграммы прямого рассеяния. Установите гейт на отдельные эритроциты, а затем выберите соответствующий канал обнаружения флуоресцентных сигналов. Количественно оцените результаты, используя медианную интенсивность флуоресценции для количественного гемолитического анализа, нагрейте и активируйте сыворотку пациента и промойте обработанные ромэном эритроциты, как показано выше.

Затем, после инкубации эритроцитов с комплементом и сывороткой пациента, как показано выше, но без анти-С-5, замедлите клетки в течение пяти минут при 664 GS с уменьшенным замедлением. Далее осторожно перенесите 90 микролитров надосадочной жидкости на новую микротитровую пластину, стараясь не перенести неповрежденные клетки и избежать образования пузырьков воздуха, а затем измерьте поглощение при соотношении от четырех 14 до 6 90 в спектрофотометрическом экспрессе. Гемолиз в процентах от лизиса образца эритроцитов, инкубированного в чистой воде.

На этом первом рисунке показаны репрезентативные диаграммы рассеяния для обработанных бролами эритроцитов, подходящие стробирования для одиночных эритроцитов можно увидеть здесь. Как правило, около 95% эритроцитов попадают в эти одноклеточные ворота. На этих гистограммах представлены репрезентативные результаты по эффекту аутоиммунной гемолитической анемии или ана.

Отложение С4 и С3 в сыворотке крови пациента показано как и ожидалось, большее количество сыворотки пациента приводит к большему отложению комплемента. Любопытно, что отложение комплемента происходит в двух отчетливых положительных пиках. Вероятно, это не вызвано гетерогенностью популяции эритроцитов, поскольку эритроциты берутся от одного донора, хотя причина этого явления все еще изучается, медианные интенсивности флуоресценции образцов нанесены на эти линейные графики, чтобы показать воспроизводимость анализов осаждения C4 и C3.

Обратите внимание на широкий разброс в отложениях различных образцов пациентов с АГ Н. Наконец, на этих графиках можно наблюдать данные гемолитического анализа образца сыворотки пациента ахха, содержащего аутоантитела к эритроцитам. Титрование с образцом сыворотки дает четкую воспроизводимую кривую с подходящим ингибитором комплемента, таким как анти С-5.

Гемолитический сигнал можно титровать, как показано на этом графике. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить активацию комплемента специфическими антителами к эритроцитам, либо с помощью проточного цитометрического анализа отложения С3 или С4, либо с помощью количественного гемолитического анализа.