Метод in vitro для визуализации экзоцитоза секреторных гранул в тучных клетках

Возьмите камерное покровное стекло, содержащее тучные клетки — иммунные клетки с секреторными гранулами, или SG, содержащие медиаторы воспаления.

Добавьте антитела IgE вместе с pH-чувствительным флуоресцентным репортером и инкубируйте.

Антитела связываются с Fc-рецепторами на тучных клетках. Репортеры интернализуются с помощью пиноцитоза, и полученные эндосомы сливаются с СГ.

Извлеките носитель. Добавить антиген, содержащий несколько IgE-связывающих эпитопов; Поместите предметное стекло под флуоресцентный микроскоп и примените необходимую длину волны возбуждения.

Кислый pH SGs гасит флуоресценцию репортера.

Антиген связывается с комплексами IgE-рецепторов на поверхности клетки, сшивая их.

Агрегация антиген-опосредованных рецепторов вызывает миграцию SG к плазматической мембране.

Белки SNARE на плазматической и SG-мембране опосредуют слияние мембран и высвобождение SG-груза, что называется экзоцитозом.

Более высокий pH среды вызывает подщелачивание SG, заставляя репортеры восстанавливать флуоресценцию.

Поступающие СГ сливаются с мембранно-расплавленными. Подщелачивание второго SG опосредует восстановление флуоресценции, подтверждая экзоцитоз соединения.

Добавьте 10 микролитров клеточной суспензии в камерное покровное стекло со свежей питательной средой, дополненной FITC-декстраном, и выращивайте клетки RBL в течение ночи. Сначала приготовьте окончательный буферный раствор Tyrode в соответствии с текстовым протоколом. Затем приготовьте 20-кратный секретагогальный реактив в свежеприготовленном буфере.

Растворите порошок хлорида аммония в буфере Тироде, чтобы получить 400-миллимолярный раствор хлорида аммония. Далее отсасывайте среду из камерного покровного стекла, и замените ее 300 микролитрами предварительно подогретого буфера Tyrode. Повторив процесс промывки два раза, пополните камеру 300 микролитрами буфера Тирода.

Далее поместите камерное покровное стекло в камеру инкубатора микроскопа и убедитесь в устойчивом положении камеры. Включите источник флуоресцентного света и выберите подходящий флуоресцентный фильтр. Как только интересующая область окажется в фокусе в центре поля зрения, выключите источник света.

Затем включите 488-нанометровый лазер с излучением, собранным в районе 500-550 нанометров. Затем откалибруйте временной интервал между получением изображений. Установите направление сканирования в положение "Двунаправленное". Не допускайте усреднения. Откройте отверстие и установите разрешение 512 на 512.

Затем визуализируйте клетки в течение времени, соответствующего конкретному типу клеток или секретагоге. Затем добавьте в камеру 16 микролитров из секретагогального раствора и продолжайте съемку. Наконец, чтобы подтвердить наличие и локализацию ФИТК-декстрана в секреторных гранулах, осторожно добавьте в камеру 16 микролитров раствора хлорида аммония.