$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Начните с чашки со стеклянным дном, содержащей трансгенных куколок дрозофилы, несущих меченый раненый эпителий с белками клеточной поверхности, демонстрирующими зеленую флуоресценцию.
Иммунные клетки куколок — или гемоциты — экспрессируют фотоконвертируемые зеленые флуорофоры в цитоплазме и красные флуоресцентные белки в ядре, облегчая отслеживание клеток.
Поврежденные клетки выделяют хемоаттрактанты — или воспалительные молекулы, привлекая гемоциты к поврежденному участку.
Конфокальная микроскопия выявляет раненый участок, окруженный зелеными эпителиальными клетками.
В процессе заживления зеленые гемоциты с красными ядрами вблизи раны удлиняют мембранные выступы — филоподии и ламелиподии и мигрируют в сторону раневой области.
Со временем, по мере диффузии хемоаттрактанта, отдаленные гемоциты мигрируют к ране, создавая иммунную клеточную волну.
Осветите субпопуляцию мигрирующих гемоцитов с помощью волны 405 нанометров. Это необратимо преобразует фотоконвертируемый флуорофор гемоцитов из зеленого в красный.
Эти фотоконвертированные гемоциты восстанавливают поврежденный эпителий и удаляются от места раны, дифференцируя фотоконвертированные гемоциты от нефотоконвертированных гемоцитов и выясняя динамику воспалительных клеток.
После ранения краев крыльев зрачка быстро перенесите чашку со стеклянным дном в соответствующий микроскоп для покадровой съемки. Затем откройте соответствующее программное обеспечение для захвата изображений.
В программном обеспечении включите соответствующие лазеры, и отрегулируйте их мощность и смещение усиления, чтобы получить достаточное количество флуоресцентного сигнала без насыщения пикселей. Как правило, минимально возможная мощность лазера в диапазоне от 5% до 20% лучше всего подходит для минимизации фотообесцвечивания.
Сосредоточьтесь на всем крыле зрачка при малом увеличении или сосредоточьтесь на ране при большом увеличении, чтобы исследовать заживление раны. Чтобы зафиксировать как восстанавливающий эпителий, так и рекрутирование воспалительных клеток, сначала настройте микроскоп на запись z-стека с помощью точной регулировки фокуса на панели управления. Просканируйте от поврежденного эпителия до внеклеточного пространства под ним, содержащего мигрирующие гемоциты.
Затем настройте программное обеспечение на запись z-срезов через крыло зрачка каждые 3 микрона или с еще более узкими интервалами. Для цейтраферной съемки записывайте z-стеки не реже одного раза в 30 секунд в течение не менее одного часа.
При использовании фотоконвертируемых зондов для выборочного фотопреобразования и маркировки подмножества клеток во время визуализации откройте соответствующие модули в программном обеспечении для визуализации для выполнения фотопреобразования и активации 405-нанометрового лазера. Затем выберите ячейки для фотоконвертации в программном обеспечении FRAP с помощью инструмента выделения.
Затем установите временной ход для преобразования фотографий на один кадр итерации и установите мощность лазера с яркостью 405 нанометров на 20%, затем нажмите «Начать эксперимент», чтобы выполнить преобразование фотографий. По завершении выйдите из модуля FRAP и вернитесь к исходному экрану изображения. Там настройте лазеры на используемые флуорофоры и визуализируйте фотопреобразованные и нефотопреобразованные клетки с помощью покадровой записи.