Визуализация сосудистого сплетения головного мозга мыши с помощью сканирующей электронной микроскопии

Возьмите сосудистое сплетение из мозга мыши в корзине для образцов.

Ткань, расположенная в желудочках мозга, содержит слой эпителиальных клеток с микроворсинками на их апикальной поверхности.

Инкубируйте ткань в фиксирующем растворе, чтобы сохранить ее клеточную архитектуру.

Промойте буфером, чтобы удалить излишки фиксатора и стабилизировать pH.

Инкубируйте ткань с тетраоксидом осмия, который связывается с липидами клеточной мембраны, сохраняя стабильность мембраны, затем смойте излишки реагента.

Обезвоживайте ткань с помощью увеличения концентрации спирта, чтобы предотвратить деформацию тканей во время визуализации.

Высушите ткань, закрепите ее на креплении для образца с углеродным покрытием, затем покройте ее проводящим слоем платины.

С помощью сканирующей электронной микроскопии сфокусируйте электронный луч на поверхность. Платиновый слой рассеивает электроны, предотвращая накопление заряда и сводя к минимуму артефакты изображения.

Детектор улавливает электроны, рассеянные от поверхности, создавая изображение ткани с эпителиальными клетками с микроворсинками.

Для проведения пробоподготовки к СЭМ необходимо перевести только что выделенное сосудистое сплетение в свежеприготовленный фиксирующий раствор и инкубировать в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. После этого промойте образец три раза, используя от 3 до 5 миллилитров 0,1 молярного буфера какодилата натрия в течение пяти минут каждый.

После этого зафиксируйте образцы в 3-5 миллилитрах 2% тетраоксида осмия в 0,1 молярном буфере какодилата натрия в течение 30 минут. Затем промойте образцы три раза по пять минут каждый, используя от 3 до 5 миллилитров сверхчистой воды. Затем обезвоживайте образцы в возрастающей серии ледяных концентраций этилового спирта в течение 15 минут на раствор этилового спирта. Используйте сушилку для критических точек, чтобы правильно высушить образец. Осторожно расположите образец на креплении для образца с помощью карбоновой наклейки и визуализируйте образцы сосудистого сплетения с помощью СЭМ.