Ультраструктурный анализ среза мозга мыши с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Возьмем фиксированный тетраоксидом осмия участок мозга мыши, встроенный в смоляной блок.

Получите изображение разреза и совместите его с заранее подготовленным изображением атласа, чтобы определить интересующую область.

Отметьте границы этого региона на блоке.

Нагрейте смолу, чтобы размягчить ее, и вырежьте отмеченный участок.

Приклейте образец к стеклянной стойке и обрежьте ее.

С помощью ультрамикротома подготовьте полутонкие и ультратонкие срезы.

Перенесите полутонкие и ультратонкие срезы на стеклянные носители и никелевые решетки соответственно.

Окрасьте полутонкие срезы красителем, который связывается с нуклеиновыми кислотами, богатой рибосомами цитоплазмой и внеклеточным матриксом.

Промойте срезы и рассмотрите их под световым микроскопом, чтобы подтвердить наличие целевой области.

Наблюдайте за ультратонкими срезами под просвечивающим электронным микроскопом.

Тетраоксид осмия повышает электронную плотность клеточных и органелльных мембран, обеспечивая высокий контраст на фоне менее электронно-плотной цитоплазмы, что позволяет визуализировать клеточную ультраструктуру.

Чтобы нанести на карту область интереса, выберите снимок, содержащий область интереса, из ранее подготовленного атласа изображений. Нарисуйте границы области интереса на разрезе изображения. Оптически наложите эти границы на внедренный образец под микроскопом и с помощью иглы диаметром один дюйм 26 калибра нацарапайте эти границы области на образце из смолы. Затем нагрейте образцы до 95 градусов Цельсия, чтобы смола размягчилась.

Затем достаньте образцы теплой смолы из духовки и с помощью лезвия бритвы иссечьте интересующие участки. Приклейте образцы к держателям из акрилового стекла соответствующего калибра и обрежьте установленные образцы для полу- и ультратонкого среза. Используйте ультрамикротом для получения полутонких срезов размером 0,7 микрометра и ультратонких срезов 70 нанометров, собирая полутонкие срезы на стеклянных носителях и ультратонкие срезы на никелевых решетках.

Окрашивайте полутонкие срезы 1% толуидинового синего в PBS в течение четырех минут, после чего последует несколько промываний в деионизированной воде перед исследованием срезов с помощью световой микроскопии. Затем ультратонкие срезы могут быть непосредственно оценены с помощью просвечивающей электронной микроскопии при напряжении 180 киловольт без дальнейших модификаций.