Характеристика и изоляция первичной микроглии мыши по плотности градиентного центрифугирования

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы изолировать популяцию микроглии высокой чистоты от грызунов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в нейроинформационном поле, такие как определение иммуномодулирующих свойств стволовых клеток на микроглии или проведение скрининговых анализов лекарств. Основным преимуществом этой методики является выделение популяции микроглии высокой чистоты без необходимости длительного пребывания в культуре.

Чтобы начать эту процедуру, вставьте кончики ножниц через отверстие в спинномозговом канале и сделайте боковые разрезы к ушному каналу. Затем аккуратно сдвиньте ткань к роструму, чтобы обнажить череп. Далее сделайте надрез вдоль сагиттального шва по направлению к брегме.

Затем вставьте кончик ножниц в брегму и сделайте боковые надрезы. После этого аккуратно снимите череп, чтобы обнажить мозг. С помощью изогнутых щипцов извлеките его и переложите в стерильную емкость объемом пять миллилитров

Промойте его два-три раза пятью миллилитрами ледяного средства для мытья, чтобы удалить кровь. В ламинарный вытяжной шкаф поместите содержимое пятимиллилитровой емкости в небольшую чашку Петри, лежащую на льду. С помощью стерильного лезвия скальпеля или стерильных ножниц удалите мозжечок и обонятельную луковицу.

Затем сделайте разрез по средней линии, чтобы разделить два полушария. Впоследствии определите менингеальный слой как очень тонкий слой клеток с красным оттенком на поверхности мозга с видимыми кровеносными сосудами. Осторожно снимите менингеальный слой тонкими щипцами, стараясь не повредить кору головного мозга.

Если менингеальный слой разорвался, продолжайте отслаивать оторванные фрагменты до его полного удаления. Затем переложите полусферы в новую маленькую чашку Петри на лед и заполните ее промывочной средой. Измельчите мозг на мелкие кусочки стерильным лезвием скальпеля.

После этого добавьте в среду 100 микролитров папаина и 150 микролитров ДНКазы1 и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После разложения разотрите ткань с помощью пипетки P1000. Если кусочки салфетки слишком велики для проникновения в пипетку, рассмотрите возможность использования стерильных ножниц для расширения кончика пипетки.

Во время этого процесса следите за тем, чтобы не вводить пузырьки в среду, так как это может снизить жизнеспособность клеток. В ламинарном проточном колпаке подготовьте 50-миллилитровую коническую трубку с 100-микрометровым клеточным фильтром. Вылейте перевариваемую среду и кусочки мозга на ситечко.

Протолкните кусочки мозга с помощью поршня стерильного трехмиллилитрового шприца растирающими движениями до тех пор, пока ткань больше не останется видимой. Непрерывно промывайте фильтр вместе с промывочным материалом на протяжении всего процесса. Это промывает все клетки, попавшие в сетчатое фильтр.

После этого центрифугируйте одноклеточную суспензию при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем приготовьте изотоник Перколла, добавив соотношение 9 к одному градиента плотности среды к 10X стерильному HBSS. Подготовьте градиенты как 30%SIP в DMEM и 70%SIP в one-X HBSS.

Например, чтобы приготовить 10 миллилитров 30% SIP, добавьте три миллилитра SIP к семи миллилитрам DMEM. Затем отсадите надосадочную жидкость из конической трубки и повторно суспендируйте клеточную гранулу восемью миллилитрами 30% SIP в DMEM. Переложите весь объем в свежую 15-миллилитровую коническую трубку.

После этого нанесите раствор 70% SIP, наполнив переводную пипетку 70% SIP, и осторожно протолкните трансферную пипетку на дно конической трубки. Когда кончик приблизится ко дну, осторожно протолкните содержимое через переводную пипетку. Затем центрифугируют слои SIP, включая ячейки, при 650 G с нулевым тормозом и четырьмя ускорениями в течение 25 минут при комнатной температуре.

Слой Percoll 70% должен быть подложен с большой осторожностью. Нарушение этого интерфейса может серьезно повлиять на захват микроглии в клеточном слое и серьезно снизить урожайность. Затем аспирируйте четыре миллилитра среды с клеточным мусором из верхней части трубки, чтобы облегчить удаление мононуклеарных клеток на следующем этапе.

Затем осторожно опустите наконечник пипетки к границе раздела и изолируйте мононуклеарные элементы от границы раздела среды с градиентом плотности 30/70. Соберите примерно три миллилитра из мутного интерфейса и перенесите его в новую 15-миллилитровую коническую трубку. После этого разбавьте смесь девятью миллилитрами HBSS, чтобы удалить среду с градиентом плотности.

Центрифугируйте на границе раздела разбавленной среды с градиентом плотности, содержащей мононуклеарные элементы при 500 G, в течение пяти минут. Отсадите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте ее одним миллилитром питательной среды. Затем повторно суспензированные клетки окрашивают трипановым синим и проводят подсчет клеток с помощью гемоцитометра.

На этом этапе собранные мононуклеарные элементы центрифугируют при 300 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить питательную среду, так как это будет мешать магнитной изоляции. Используя то же количество клеток, полученное ранее, повторно суспендируйте в 10-8 ядровых клетках на миллилитр в PBS, содержащем 2% FBS и одну миллимолярную ЭДТА в диапазоне объема от 0,1 до 2,5 миллилитров. Затем добавьте полный объем ядросодержащих клеток в PBS в свежую пятимиллилитровую полистирольную пробирку с круглым дном.

Затем добавьте 50 микролитров реагента для мечения CD11b PE на один миллилитр образца. Выдерживайте его при комнатной температуре в течение 15 минут в защищенном от света месте. После этого добавьте 70 микролитров отборного коктейля на один миллилитр пробы.

Выдерживайте его при комнатной температуре в течение 15 минут в защищенном от света месте. Затем смешайте магнитные частицы, пипетируя вверх и вниз более пяти раз. Добавьте к образцу 50 микролитров на миллилитр и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут в защищенном от света месте.

Если общий объем клеточной смеси составляет менее 2,5 миллилитров, долейте до этого объема PBS, содержащий 2% FBS и одну миллимолярную ЭДТА, и перемешайте путем аккуратного пипетирования два-три раза. Затем поместите трубку в магнит и выдерживайте при комнатной температуре в течение пяти минут. Одним непрерывным движением полностью переверните магнит, содержащий трубку, на две-три секунды, чтобы вылить надосадочную жидкость.

Верните магнит в вертикальное положение и снимите трубку с магнита. После этого вымывают оставшиеся клетки из колонки, повторяя процедуры. Повторно суспендируйте клетки в желаемой питательной среде.

Промойте боковую сторону емкости для сбора, чтобы собрать клетки с боковых сторон пробирки и максимизировать выход. Как видно на этом рисунке, изолированные первичные микроглии сохраняют свое сферическое клеточное тело и отчетливую разветвленную структуру. Вот репрезентативные факты о выделенной микроглии.

Комбинированное окрашивание аннексина V и йодида пропидия позволяет классифицировать апоптотические, некротические или живые клетки после стимуляции ЛПС. Среда, кондиционированная hAEC, значительно снижает апоптоз микроглии по сравнению с контрольной группой, что позволяет предположить форму защиты на этом типе клеток. После освоения этой техники ее можно выполнить за шесть-восемь часов при правильном выполнении.

При выполнении этого метода важно быть очень осторожным при укладке слоев Percoll, так как этот шаг окажет наибольшее влияние на урожайность. Следуя этому методу, другие процедуры, такие как анализ фагоцитарной функции или совместное культивирование с нейронами, могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы об иммуномодулирующих свойствах выбранного вами типа клеток первичной микроглии. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в этой области, чтобы выяснить, как первичная микроглия может модулироваться при перинатальном повреждении головного мозга.

Применение этого метода распространяется на терапию и диагностику перинатального повреждения головного мозга, поскольку он позволяет охарактеризовать тип первичных иммунных клеток, который, как известно, участвует в нейроинформации, которая приводит к двигательной и когнитивной дисфункции. Хотя этот метод может дать представление о двигательных расстройствах, таких как церебральный паралич, он также может быть применен при других расстройствах, где микроглия играет роль в патогенезе, таких как болезнь Альцгеймера. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы хотели разработать технику для быстрой характеристики микроглии, обходя потенциальные эпигенетические изменения после длительного пребывания в культуре.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделить популяцию микроглии высокой чистоты для последующей характеристики.