Смешанных иерархических изображений последовательных секций для нахождения конкретных клеточных мишеней в больших объемах

Общая цель этого рабочего процесса заключается в определении определенных мишеней для ультраструктурной визуализации в ткани с помощью световой микроскопии с последующей 3D-визуализацией в СЭМ с очень высоким разрешением. Представленный здесь рабочий процесс визуализации может помочь ответить на ключевые вопросы об ультраструктуре клеток или тканей в ряде областей, таких как клеточная биология, биология развития, нейробиология или даже патология. Основное преимущество метода, который фактически основан на матричной томографии, заключается в том, что разрезание ткани на массивы серийных срезов позволяет легко идентифицировать целевые структуры, даже если изначально они погружены внутрь исходного объема образца.

Матричная томография изначально была представлена в контексте нейробиологии, но она также может применяться к широкому спектру других систем, включая бактерии, растения, животных и даже образцы пациентов в условиях патологии. Люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что собрать много серийных разделов очень сложно. Работа без дополнительной опоры может привести к потере секций или нарушению работы лент.

С помощью крошечной щетки, сформированной из нескольких волосков, закрепленных на зубочистке, тщательно смажьте переднюю и заднюю стороны предварительно подстриженного блока клеевой смесью. Выполните этот шаг быстро, потому что растворитель этой смеси испаряется в течение нескольких секунд. Пока образцы сохнут, вырежьте кусочки силиконовых пластин до размера, который помещается в лодочку ножа и отметьте их алмазным начертателем.

Затем очистите силиконовую пластину вручную с помощью изопропанола и безворсовой салфетки. Закрепите подложку на одном конце несущей пластины с помощью съемного клея. После затвердевания плазма активирует подложку с помощью тлеющего разряда с воздухом для получения гидрофильной поверхности.

Когда установленная подложка находится ближе к краю ножа, вставьте держатель в зажим держателя подложки. Далее вставьте в держатель ножа гигантский алмазный нож и установите угол зазора на ноль градусов. Затем наполните лодочку для ножа дистиллированной водой.

Подойдите к ножу так, чтобы он находился в одном-двух миллиметрах от образца. Затем опустите субстрат в воду с помощью винтов с первого по третий держателя субстрата. Проверьте, чтобы линия воды располагалась в верхней трети субстрата.

Поскольку при использовании кремниевой пластины трудно увидеть дорожный просвет, опускайте подложку до тех пор, пока не почувствуете, как она касается пола. Затем поднимите субстрат на небольшое количество. Следите за тем, чтобы ни субстрат, ни носитель не касались лодочки ножа во время резки.

Далее с помощью шприца или пипетки отрегулируйте уровень воды в лодке. Наблюдая в бинокль, добавляйте или удаляйте воду до тех пор, пока на всей поверхности воды не появится равномерное отражение верхнего светового освещения ультрамикротома. После завершения настройки начните секционирование образца.

Когда несколько секций будут срезаны, остановите процесс секции и освободите ленту от лезвия ножа, аккуратно поглаживая лезвие ножа ресницей или очень мягкой кошачьей шерстью. Проведите ленту по направлению к подложке и осторожно надавите на первую секцию ленты, чтобы прикрепить ее к сухой части подложки. Продолжайте секционирование образца и прикрепление лент к подложке.

Начните с одной стороны подложки и постепенно продвигайтесь к другой с каждой новой лентой. Когда подложка будет полностью покрыта лентами, аккуратно поднимите подложку из лодочки ножа с помощью микроманипуляторных винтов держателя подложки. Дайте массиву лент высохнуть, а затем храните его в защищенном от пыли месте.

После высыхания как можно скорее снимите клеевую подложку с носителя. Затем окрасьте образец для световой микроскопии, как описано в прилагаемом текстовом протоколе, и выполните визуализацию. Далее окрашиваем образец для электронной микроскопии и крепим его на алюминиевые заглушки с помощью липкой угольной прокладки.

Теперь визуализируйте эти массивы в полевом эмиссионном сканирующем электронном микроскопе. Чтобы избежать зарядки, используйте энергию первичных электронов три кВ или ниже и ток луча от 50 до 800 пикоампер. При использовании стеклозащитных накладок с покрытием ITO подсоедините проводящую поверхность к держателю микроскопа с помощью медной ленты и серебряной краски.

Первым шагом в каскаде иерархической визуализации является создание обзора массива таким образом, чтобы можно было распознать отдельные разделы. Сначала определите четыре угла массива, построив на графике изображение каждого угла при низком увеличении, около 100x, а затем создайте ROI, охватывающий весь массив. Назначьте протокол визуализации для этой окупаемости инвестиций со следующими параметрами.

Используйте детектор вторичных электронов для высокоскоростной визуализации с коротким временем задержки около 0,2 микросекунды. Выберите большой размер изображения в пикселях и размер плитки 2000 на 2000 пикселей. В результате получается очень зашумленное изображение, но даже здесь видна ткань внутри разреза.

Затем сгенерируйте набор сечений, создав область интереса, обведя контуром только ткань в первом разделе. Клонируйте его на все последующие разделы с помощью инструмента штампа. При необходимости поворачивайте интересующие области, чтобы приспособиться к изогнутым лентам.

Назначьте протокол на участок, который лучше всего отображает подструктуру ткани. Здесь был использован промежуточный размер пикселя 60 нанометров, размер плитки 12000 на 12000 пикселей и время задержки 3,2 микросекунды. Из-за плохого качества был создан второй набор секций, описывающий несколько выбранных ячеек, с использованием меньшего размера пикселя и более чувствительного детектора.

Теперь можно очень хорошо распознавать две клетки-мишени. Создание набора сайтов в наборе разделов, содержащем целевую структуру для создания изображений SEM с более высоким разрешением. Сделайте область интереса достаточно большой, чтобы учесть поэтапную точность.

Проверяйте и корректируйте позиции сайтов. Автонастройка необходима, когда изображено много секций. Важно расположить интересующие области так, чтобы центр не сидел на пустом материале без структурных деталей, например, вакуолей.

Затем определите настройки автофокусировки и проверьте производительность изображения по всей длине ленты на небольшой области интереса, которая находится недалеко от места, на котором будет изображено изображение. Затем определите протокол визуализации для получения SEM с высоким разрешением. Чтобы увидеть мембранные отсеки, выберите размер пикселя изображения от трех до пяти нанометров.

Выбирайте время задержки в зависимости от детектора, чтобы изображение не было слишком зашумленным. Поскольку рабочая область должна пройти большое расстояние между записью этого и этого раздела, определите значения фокуса по крайней мере на первом участке каждой ленты с помощью параметра протокола проверки. Затем запустите автоматизированную визуализацию SEM по всей серии целевых областей интереса.

По завершении экспортируйте полученные данные в виде серии изображений, желательно в формате TIF. Импортируйте серии изображений на Фиджи в виде виртуального стека. Далее обрежьте стек для дальнейшей обработки, обрезав участок как можно ближе к интересующей структуре.

Также отрегулируйте яркость и контрастность и сохраните стек. После обрезки и оптимизации откройте новый TrakEM в меню «Файл». Щелкните правой кнопкой мыши по полю изображения и импортируйте стек в TrakEM как один срез на слой.

Щелкнув правой кнопкой мыши, выберите опцию Выровнять слои. Выберите метод наименьших квадратов в качестве режима, установите диапазон от первого до последнего и выберите «Нет» в качестве эталона. Затем выберите значения настроек по умолчанию и выберите Жесткое в качестве желаемого преобразования.

Когда регистрация будет завершена и будет удовлетворительной, сохраните выровненный набор данных, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав «Экспорт». Сделайте плоское изображение, установите диапазон от первого до последнего изображения, и пусть программа покажет полученный стек. Когда закончите, сохраните стопку в формате TIF.

После подготовки массив секций выглядит как массив, состоящий из нескольких лент последовательных секций. В этом разделе представлен обзор кончика корня арабидопсиса, окрашенного йодидом пропидиума. Последовательные участки этого образца были выровнены, как описано в протоколе, и объединены для отображения образца в 3D в виде одного файла фильма.

Здесь можно увидеть две клетки-мишени, которые позже будут изображены с нанометровым разрешением в SEM. После дополнительного окрашивания уранилацетатом и цитратом крови матрицы были визуализированы в электронном микроскопе. На этом статическом изображении показан срез образца, сначала полученный с разрешением 20 нанометров, а во втором раунде изображения — с разрешением пять нанометров.

Здесь 210 последовательных изображений с электронного микроскопа были выровнены и обрезаны, как описано в протоколе. Видео нацелено только на две клетки и показывает, как вакуоли внутри клеток расположены и иногда соединяются в 3D. Автоматизированная иерархическая визуализация массивов в СЭМ, показанная здесь, может обеспечить бесшовное картирование на различных уровнях разрешения, от обзора всего массива до субклеточных деталей.

При наибольшем увеличении распознаются вакуоли, митохондрии, ядро и эндоплазматический ретикулум. После освоения размещение секционных лент рядом друг с другом на типичной подложке может быть выполнено за несколько часов, если это выполнено правильно. Это может обеспечить сотни срезов на одной подложке для визуализации.

Время визуализации для такого большого количества срезов может варьироваться от одного микроскопа к другому, особенно если ваши любимые приборы для визуализации имеют разные уровни автоматизации. Интересно отметить, что общий рабочий процесс можно легко сочетать с другими методами визуализации, такими как стандартное окрашивание гистограмм или даже кандолюминесценция, или его просто можно использовать как самостоятельный инструмент для артологической визуализации больших объемов. Еще одним аспектом этого рабочего процесса является легкая доступность.

Первоначальные исследования возможны без дополнительных инструментов или автоматизации, то есть без больших вложений. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о рабочем процессе и о том, как мультимодальная, а также иерархическая визуализация может быть использована для определения и отображения интересных структур в большом 3D-объеме с различными уровнями разрешения.