Выполнение пользовательских Эксперименты Microarray микроРНК

Общая цель этой процедуры заключается в проведении эксперимента с микрочипами на основе микроРНК. Это достигается путем приобретения напечатанных слайдов микрочипов, которые содержат библиотеку зондов микроРНК, и подготовки образцов РНК с подходящим качеством и количеством. Далее контролируемый образец РНК и ДНК А помечаются флуоресцентными красителями.

Затем меченые нуклеиновые кислоты добавляют на предметное стекло микрочипа для гибридизации. Наконец, предметное стекло микрочипа промывается и сканируется, а затем предметное стекло регенерируется. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают экспрессию микроРНК в масштабах всего генома путем анализа предметного стекла на предмет интенсивности гибридизации отдельных зондов микроРНК.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области экспрессии генов, например, как нормальные физиологические условия или дифференциальные патологические состояния влияют на микропотребности в экспрессии в глобальном масштабе. Качество изготовления микрочипов является одним из наиболее важных факторов для успеха эксперимента с микрочипами. После выделения РНК способом, который сохраняет малые РНК и суспендирует ее в концентрации, равной или превышающей два миллиграмма на миллилитр, пометить РНК в реакционном объеме 20 микролитров, предварительно смешав около 25 микрограммов общей РНК с 0,5 микрограммами пяти простых P-C-U-D-Y 5 4 7 3 прайм в одном буфере X HEP, дополненном Т-четырьмя РНК-лигазой 1D TT, и ТП. Если доступно меньше РНК, уменьшите количество РНК и реакцию.

Если РНК сильно разбавлена, добавьте носитель, такой как дрожжи, TRNA, чтобы помочь с выпадением осадка, инкубируйте реакцию на льду в холодильнике от двух до 24 часов. Далее добавьте ацетат натрия до 0,3 моляра, а затем три объема этанола и осадите РНК на ночь при температуре минус 20 градусов Цельсия. Чтобы использовать предметные стекла в первый раз, предварительно гибридизируйте их в отфильтрованном растворе из трех XSSC, 0,1% SDS и 0,2% BSA в течение 30-60 минут при 37 градусах Цельсия.

Далее погрузите горки в воду несколько раз. Затем в изопропаноле высушите предметные стекла с помощью центрифуги с адаптером для слайдов при 100-кратном G в течение пяти минут при 22 градусах Цельсия. Промойте полосы подъемника в воде.

Затем в этаноле перед сушкой на воздухе поместите предметное стекло внутрь основания камеры гибридизации микрочипа, а на верхнюю часть предметного стекла поместите подъемное стекло так, чтобы подъемное стекло охватывало зонд и его белые полосы. Прикоснитесь к предметному стеклу в темноте, открутите осажденную меченую РНК, промойте ее один раз 70% этанолом и высушите гранулу на воздухе. Лепешка должна быть красноватого цвета.

Приготовьте гибридизационный раствор с использованием от одной 15-й до одной 100-й по объему очищенной меченой референсной ДНК на образец РНК Полностью растворите гранулу РНК примерно 60 микролитрами гибридизационного раствора, чтобы гарантировать, что гибридизационный раствор не высохнет. Во время инкубации добавьте по 20 микролитров воды в каждую из увлажняющих лунок. В основании камеры гибридизации микрочипа.

Добавьте смесь меченых РНК и ссылочную ДНК на предметное стекло. С помощью тонкого наконечника пипетки осторожно коснитесь края ползунка подъемника и через всасывание. Позвольте раствору войти в пространство между скольжением подъемника и горкой.

Поместите крышку камеры гибридизации на основание. Затем запечатайте камеру металлическими зажимами. Поместите всю камеру внутрь полиэтиленового пакета, который идет в комплекте с камерной кассетой.

Наконец, поместите камерную кассету внутрь контейнера с влажным бумажным полотенцем. Затем накройте контейнер полиэтиленовой пленкой и поместите его в инкубатор для клеточных культур с температурой 37 градусов Цельсия примерно на 24 часа. Для обработки предметных колец после гибридизации разберите камерные кассеты, поочередно погрузите в них предметное стекло, а его подъемник скольжения пополам XSSC при температуре 22 градуса Цельсия.

Слип атлета естественным образом упадет с горки, дважды промоет горки в 0,8 XSSC, затем три раза в 0,4 XSSC, в общей сложности одну-две минуты. Высушите предметные стекла с помощью центрифуги с адаптером для предметных стекол. Затем отсканируйте слайды с помощью сканера микрочипов и используйте такую программу, как синий предохранитель, для количественной оценки интенсивности в файлах изображений.

Осмотрите отдельные пятна, чтобы исключить аномальные пятна, которые обычно возникают при печати на предметных стеклах или работе со слайдами после гибридизации. Для анализа и представления данных используйте такие программы, как gene springing и excel для повторного использования микрочипа. Снимите предметное стекло, промыв его в воде, а затем погрузите в посуду для окрашивания с предварительно подогретым одним миллимоляром NAOH и 0,1 XSSC при температуре 62 градуса Цельсия на 10-20 минут.

Повторите инкубацию во второй раз. Промойте предметные стекла несколько раз в воде в течение 60 минут с легким встряхиванием при температуре 22 градуса Цельсия. Высушите предметные стекла с помощью центрифуги и храните при температуре 22 градуса Цельсия.

Предметные стекла можно использовать без предварительной гибридизации. На этом рисунке показано отсканированное изображение микрочипа, демонстрирующее очень точные и сильные сигналы гибридизации. Красные пятна образовались в результате гибридизации референсной ДНК из образца меченой РНК DY 5 47, а желтые пятна были результатом гибридизации ДНК и РНК с одними и теми же зондами.

Коэффициенты корреляции Пирсона между техническими репликами гибридизации микрочипов составляют около 0,99, что указывает на превосходную воспроизводимость. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как проводить индивидуальный микролучевой эксперимент не только для количественного определения микроназы, но и для количественного определения других типов нуклеиновых кислот, таких как мРНК.