Индуцирование сайта Конкретная репликации засорение

Общая цель данного эксперимента заключается в остановке репликационной вилки на нуклеопротеиновом блоке и наблюдении за структурами ДНК в месте блока для изучения путей репарации ДНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о репликации и репарации ДНК, например, о том, как обрабатывается ДНК, когда аппарат репликации клетки сталкивается с белковым препятствием. Основным преимуществом данной методики является возможность обратимой остановки репликационной вилки в определенном месте хромосомы во всей популяции живых клеток.

Эту процедуру продемонстрируют сотрудники моей лаборатории: доктор Карла Меттрик, аспирантка Джорджия Уивер и Тейла-Энн Корошер. Для данной процедуры используется штамм E.coli, несущий массив операторов тетрациклина в плазмиде pKM1. pKM1 кодирует TetR-YFP — индуцибельный белок-репрессор тетрациклина, меченный желтым флуоресцентным белком.

Разбавьте свежую ночную культуру данного штамма E.coli до оптической плотности при 600 нанометрах, равной 0,01, в разбавленной комплексной среде с антибиотиками, необходимыми для селекции. Выращивайте культуру при 30 degrees celsius с перемешиванием до достижения оптической плотности при 600 нанометрах от 0,05 до 0,1. Отберите пробу объемом 10 milliliter в качестве неиндуцированного контроля.

Добавьте 0,01% арабинозы в оставшуюся культуру для индукции экспрессии TetR-YFP из pKM1. Продолжайте выращивание обеих культур — неиндуцированной и индуцированной — при 30 °C с перемешиванием. Через один час с помощью флуоресцентной микроскопии проверьте наличие одного фокусного пункта в каждой клетке индуцированной культуры.

Если подтверждено, что индуцированные клетки заблокированы (на что указывает наличие единичного фокуса более чем у 70% клеток), зафиксируйте оптическую плотность и отберите 7.5 milliliters образца для анализа методом двумерного гель-электрофореза. Отберите эквивалентный образец из неиндуцированной контрольной культуры. Перед проведением флуоресцентной микроскопии подготовьте агарозные подушечки для предотвращения смещения клеток во время визуализации.

Для каждой агарозной подушечки нанесите пипеткой 500 µL расплавленного агароза на предметное стекло и сразу накройте покровным стеклом до того, как агароза затвердеет. Храните стекла между влажными салфетками при температуре 4 °C до востребования. При необходимости проверки клеток снимите покровное стекло с агарозной подушечки и нанесите пипеткой 10 µL бактериальной культуры в центр подушечки.

Примерно через пять минут, когда агарозная подушка высохнет, верните покровное стекло на место. Нанесите каплю иммерсионного масла на покровное стекло и поместите предметное стекло под объектив. Визуализируйте клетки с помощью фазово-контрастной микроскопии при 100-кратном увеличении.

В диалоговом окне Acquire в программном обеспечении для визуализации установите время экспозиции (Exposure Time) на 100 milliseconds. Выберите Acquire для получения изображения. Не перемещайте предметный столик.

В диалоговом окне Acquired выберите YFP в качестве освещения для внешнего затвора, связанного с камерой. Установите время экспозиции (Exposure Time) на 1,000 миллисекунд. Выключите освещение столика и нажмите Acquire для получения изображения флуоресценции.

Для начала данной процедуры добавьте азид натрия в предварительно собранные образцы культур до конечной концентрации 0,1% и инкубируйте на льду не менее пяти минут. Центрифугируйте клетки при 5 000 ×g в течение десяти минут. Удалите супернатант.

Ресуспендируйте каждый осадок клеток в 200 µL буфера PIV и перенесите клетки в микроцентрифужную пробирку. Центрифугируйте для осаждения клеток и удалите супернатант. Обработайте предметное стекло 40 µL соответствующего водоотталкивающего состава для стекла или силиконового раствора.

Протрите предметное стекло салфеткой до полного высыхания. Ресуспендируйте клетки с наименьшей плотностью в 50 µL PIV и поместите в термоблок при температуре 50 °C. Для всех остальных образцов скорректируйте объемы PIV таким образом, чтобы конечная плотность клеток в каждой пробирке была одинаковой.

Добавьте в образцы равный объем свежеприготовленного 0.8% раствора агарозы в PIV. Держите образцы в термоблоке, чтобы поддерживать температуру выше 50 °C и предотвратить затвердевание. Нанесите капли по 20 µL суспензии клеток с агарозой на обработанный предметное стекло для получения полусферических плагов.

После затвердевания пробок аккуратно перенесите все пробки из одного образца в одну микроцентрифужную пробирку и добавьте 1 мл буфера для лизиса клеток. Инкубируйте при 37 °C в течение двух часов. По истечении двух часов удалите буфер для лизиса клеток и добавьте 1 мл раствора EDTA-Sarkosyl-Proteinase K (ESP).

Инкубируйте при 50 °C в течение ночи или до тех пор, пока пробки не станут прозрачными. После того как пробки станут прозрачными, удалите буфер ESP и перенесите пробки в пробирку объемом 15 мл. Добавьте 12 мл ТЕ-буфера и оставьте на 30 минут.

Промойте плаги с TE-буфером в общей сложности пять раз. Храните плаги при температуре четыре градуса цельсия в одном миллилитре TE-буфера. Для анализа промежуточных продуктов репликации ДНК в агарозных плагах подвергают расщеплению подходящим рестрикционным ферментом для интересующего участка.

В данном примере EcoRV разрезает ДНК непосредственно перед массивом, внутри массива и после массива, в результате чего в интересующей области образуются фрагменты размером 5,5 kb и 6,7 kb. Для начала этой процедуры перенесите агарозный блок в новую микроцентрифужную пробирку и добавьте 150 µL буфера для рестриктазы. Добавьте от 25 до 100 единиц рестриктазы и проведите расщепление при 37 °C в течение шести-восьми часов.

Приготовьте 0,4% агарозный гель при температуре 4 °C. Налейте 300 мл расплавленной агарозы в гель-кассету размером примерно 25 на 25 см. Вставьте гребенку, чтобы ширина лунок была примерно равна диаметру плага.

После застывания геля извлеките гребенку и перенесите гель при комнатной температуре. С помощью инокуляционной петли поместите один из переваренных агарозных плагов в лунку, расположив плоскую сторону плага примыкающей к стенке лунки, через которую ДНК будет входить в гель. Таким же образом поместите по одному плагу в каждую вторую лунку.

Добавьте пипеткой расплавленный 0,4% агарозный гель в лунки, чтобы зафиксировать пробки на месте. Внесите маркер ДНК размером 1 kb в пустую лунку, оставив промежуток между маркером и образцами. Проводите электрофорез в 1xTBE при комнатной температуре в течение ночи.

На следующий день окрасьте гель в водяной бане, содержащей 0,3 micrograms per milliliter бромистого этидия, в течение 20 минут. Визуализируйте ДНК с помощью длинноволнового УФ-транслюминатора и вырежьте фрагмент каждой дорожки ровным прямым срезом, стараясь минимизировать количество избыточного агарозы по обе стороны от дорожки. Поместите вырезанный фрагмент дорожки геля в лоток для геля под углом 90 градусов к направлению миграции ДНК.

Следующим шагом является приготовление 300 миллилитров агарозы для геля второго измерения. Когда агароза остынет до 50 °C, пипеточный способом залейте расплавленную агарозу вокруг срезов геля, чтобы зафиксировать их положение. Залейте оставшуюся агарозу в кювету так, чтобы ее уровень был как минимум на одном уровне со срезами геля.

После затвердевания геля проведите электрофорез в 1xTBE, содержащем 0,3 мкг/мл бромистого этидия, при температуре 4 °C до тех пор, пока ДНК не мигрирует примерно на 10 см. Вырежьте блоки, в которых присутствует геномная ДНК, включая часть геля выше них, чтобы захватить невидимую ДНК. ДНК в геле затем визуализируют методом Саузерн-гибридизации, как описано в текстовом протоколе.

В данной системе блок репликации подтверждался тем, что у большинства клеток наблюдался один фокус, соответствующий одной копии массива внутри клетки. Добавление ангидротетрациклина снимало блок, и последующая дупликация массива визуализировалась как накопление клеток с множественными фокусами. Клетки с заблокированной репликацией также демонстрировали ингибирование роста, которое устранялось при последующем культивировании в присутствии ангидротетрациклина.

Для анализа промежуточных продуктов репликации ДНК подвергли электрофорезу в первом измерении. Затем интересующую ДНК вырезали, и электрофорез во втором измерении привел к образованию диагонали линейной ДНК. Саузерн-гибридизация ДНК массива выявила в неблокированном образце две точки, соответствующие ожидаемым фрагментам массива размером 5,5 kb и 6,7 kb.

В блокированном образце наблюдалось уменьшение пятна 5,5 kb и появление эллиптического сигнала, указывающего на накопление Y-образных молекул ДНК. Добавление ангидротетрациклина устранило сигнал Y-образной ДНК. Еще одним распространенным промежуточным продуктом является соединение Холдейна, которое визуализируется в виде конусного сигнала в верхней части Y-дуги и всплеска от линейной ДНК в конце Y-дуги.

После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе может занять восемь дней. Несмотря на то, что это двухмерная (2D) процедура, важно помнить, что качество ДНК-плага имеет решающее значение для оптимальной визуализации структур ДНК.