Индуцирование сайта Конкретная репликации засорение E. палочки Использование системы Люминесцентные репрессора оператора

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы остановить репликационную вилку в нуклеопротеиновом блоке и наблюдать за структурами ДНК в месте блока с целью изучения путей репарации ДНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о репликации и репарации ДНК, например, о том, как ДНК обрабатывается, когда репликационный аппарат клетки сталкивается с белковым препятствием. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем обратимо остановить репликационную вилку в определенном месте хромосомы во всей популяции живых клеток.

Эту процедуру будут демонстрировать следующие сотрудники моей лаборатории: доктор Карла Меттрик и аспирантка Джорджия Уивер, а также Тайла-Энн Корочер. Для этой процедуры используется штамм E.coli, несущий массив операторов тетрациклина в плазмиде pKM1. pKM1 кодирует TetR-YFP, индуцируемый желтый флуоресцентный белок-репрессор тетрациклина.

Разведите свежую ночную культуру этого штамма E.coli до оптической плотности на 600 нанометров 0,01 в разбавленной комплексной среде с антибиотиками по мере необходимости. Выращивают культуру при 30 градусах Цельсия с встряхиванием до оптической плотности в 600 нанометров от 0,05 до 0,1. Удалите образец объемом 10 миллилитров, чтобы он служил в качестве неиндуцированного контроля.

Добавьте 0,01% арабинозы к оставшейся культуре, чтобы вызвать выработку TetR-YFP из pKM1. Продолжайте выращивать как неиндуцированные, так и индуцированные культуры при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием. Через час проверьте наличие одной фокальной точки в каждой клетке индуцированной культуры с помощью флуоресцентной микроскопии.

Если у индуцированных клеток подтверждена блокировка, на что указывают более 70% клеток, имеющих один очаг, зарегистрируйте оптическую плотность и удалите 7,5 миллилитров образца для анализа методом двумерного гель-электрофореза. Удалите эквивалентный образец из неиндуцированной контрольной культуры. Перед флуоресцентной микроскопией подготовьте агарозные прокладки для предотвращения движения клеток во время визуализации.

Для каждой агарозной прокладки нанесите пипеткой 500 микролитров расплавленной агарозы на предметное стекло микроскопа и наложите покровное стекло непосредственно перед застыванием агарозы. Храните предметные стекла между влажными салфетками при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся. Когда придет время проверить клетки, снимите покровную салфетку с агарозной прокладки и пипеткой нанесите 10 микролитров бактериальной культуры на центр прокладки.

Примерно через пять минут, когда агарозная прокладка высохнет, установите на место покровную крышку. Нанесите каплю иммерсионного масла на покровное стекло и поместите предметное стекло под оптику. Визуализируйте клетки с помощью фазовой микроскопии при 100-кратном увеличении.

В диалоговом окне Получение данных в программном обеспечении обработки изображений установите для параметра Время экспозиции значение 100 миллисекунд. Выберите «Получить», чтобы сделать снимок. Не перемещайте сцену.

В диалоговом окне Получено выберите YFP в качестве подсветки для внешнего затвора, связанного с камерой. Установите время экспозиции на 1 000 миллисекунд. Выключите освещение сцены и выберите «Получить», чтобы получить флуоресцентное изображение.

Чтобы начать эту процедуру, добавьте азид натрия в ранее собранные образцы культуры до конечной концентрации 0,1% и инкубируйте на льду не менее пяти минут. Центрифугируйте клетки при 5 000 раз g в течение десяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 200 микролитрах буфера PIV и перенесите клетки в микрофугальную пробирку. Микроцентрифуга для гранулирования клеток и удаления надосадочной жидкости. Обработайте предметное стекло 40 микролитрами соответствующего стекла водоотталкивающим или силиконовым раствором.

Потрите предметное стекло салфеткой до полного высыхания. Ресуспендируйте клетки с самой низкой плотностью клеток в 50 микролитрах PIV и поместите при температуре 50 градусов Цельсия в тепловой блок. Для всех остальных образцов отрегулируйте объемы PIV таким образом, чтобы конечная плотность клеток в каждой пробирке была одинаковой.

Добавьте к образцам равный объем свежеприготовленного 0,8%-ного раствора агарозы в PIV. Держите образцы в нагревательном блоке, чтобы убедиться, что их температура превышает 50 градусов Цельсия, чтобы предотвратить затвердевание. Поместите 20 микролитров клеточно-агарозной суспензии на обработанное предметное стекло, чтобы получились пробки полусферической формы.

Когда пробки затвердеют, аккуратно вставьте все пробки из одного образца в одну микропробирку и добавьте один миллилитр буфера для лизиса клеток. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Через два часа удалите буфер для лизиса клеток и добавьте 1 миллилитр раствора ЭДТА-саркозил-протеиназы К или ESP.

Инкубируйте при температуре 50 градусов Цельсия в течение ночи или до тех пор, пока пробки не станут прозрачными. Как только пробки станут прозрачными, снимите буфер ESP и переложите пробки в 15-миллилитровую трубку. Добавьте 12 миллилитров TE буфера и дайте постоять 30 минут.

Промойте пробки в общей сложности пять раз с помощью TE-буфера. Храните вилки при температуре четыре градуса Цельсия в одном миллилитре TE буфера. Для анализа промежуточных продуктов репликации ДНК в агарозных пробках расщепляют с помощью соответствующего фермента рестрикции для интересующей области.

В этом примере EcoRV разрезает ДНК непосредственно перед матрицей, внутри матрицы и после матрицы, чтобы получить фрагменты размером 5,5 КБ и 6,7 КБ в интересующей области. Чтобы начать эту процедуру, перенесите агарозную пробку в свежую микропробирку и добавьте 150 микролитров буфера фермента рестрикции. Добавьте от 25 до 100 единиц фермента рестрикции и варите при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести-восьми часов.

Приготовьте 0,4%-ный агарозный гель при четырех градусах Цельсия. Налейте 300 миллилитров расплавленной агарозы в гелевую ванночку размером примерно 25 на 25 сантиметров. Вставьте гребень, чтобы лунки были примерно такой же ширины, как диаметр пробки.

Когда гель застынет, снимите расческу и переместите гель до комнатной температуры. Используя петлю инокуляции, вставьте одну из переваренных агарозных пробок в лунку, расположив плоскую сторону пробки напротив той стороны лунки, где ДНК будет входить в гель. Таким же образом вставьте одну пробку в каждую вторую лунку.

Пипетка расплавила 0,4% агарозы в лунки для герметизации пробок на месте. Загрузите лестницу ДНК объемом один кб в пустой колодец, оставив зазор между лестницей и образцами. Проведите гель на ночь в 1xTBE при комнатной температуре.

На следующий день окрашивайте гель на водяной бане, содержащей 0,3 микрограмма на миллилитр бромида этидия, в течение 20 минут. Визуализируйте ДНК с помощью длинноволнового ультрафиолетового трансиллюминатора и вырежьте каждый фрагмент полосы с помощью прямого ровного среза, сводя к минимуму включение избытка агарозы по обе стороны полосы. Поместите иссеченную гелевую дорожку в лоток для геля под углом 90 градусов к направлению миграции ДНК.

Следующим этапом является приготовление 300 миллилитров агарозы для геля второго измерения. Когда агароза остынет до 50 градусов Цельсия, обведите пипеткой расплавленную агарозу вокруг кусочков геля, чтобы закрепить их положение. Оставшуюся агарозу высыпаем в лоток на глубину, которая находится не менее чем на уровне гелевых долек.

Как только гель затвердеет, электрофорируйте его в 1xTBE, содержащем 0,3 микрограмма на миллилитр бромида этидия при четырех градусах Цельсия, пока ДНК не мигрирует примерно на 10 сантиметров. Вырежьте блоки, в которых присутствует геномная ДНК, включая гель над ней, чтобы включить ДНК, которая не видна. ДНК внутри геля впоследствии визуализируется с помощью южной гибридизации, как описано в текстовом протоколе.

В этой системе блок репликации был подтвержден большинством клеток, содержащих один фокус, соответствующий одной копии массива внутри клетки. Добавление ангидротетрациклина обращало блокировку и последующее дупликацию матрицы визуализировалось как скопление клеток с множественными очагами. Клетки с заблокированной репликацией также показали ингибирование роста, которое было обращено вспять последующим ростом в присутствии ангидротетрациклина.

Для анализа репликационных промежуточных продуктов ДНК подвергали электрофорезу в первом измерении. Затем интересующая нас ДНК была вырезана, и электрофорез второго измерения привел к диагонали линейной ДНК. Южная гибридизация ДНК матрицы выявила два пятна в незаблокированном образце, соответствующие ожидаемым фрагментам массива размером 5,5 и 6,7 КБ.

Заблокированный образец показал уменьшение пятна на 5,5 кб и добавление эллиптического сигнала, указывающего на накопление Y-образной ДНК. Добавление ангидротетрациклина устраняло Y-образный сигнал ДНК. Другим распространенным промежуточным соединением является соединение Холлидея, визуализируемое как сигнал конуса на вершине Y-дуги и спайк от линейной ДНК в конце Y-дуги.

После освоения этой техники ее можно сделать за восемь дней, если она правильно отформована. При проведении 2D-процедуры важно помнить, что качество пробок ДНК имеет решающее значение для оптимальной визуализации структур ДНК.