Визуализация УФ-индуцированной репликации промежуточных Е. палочки Использование двумерных агарозном гель-анализа

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации структурных промежуточных продуктов ДНК, которые возникают, когда репликация сталкивается с повреждениями ДНК с помощью двумерного гелевого анализа. Это достигается путем выделения ДНК из активно делящихся клеток, в которых были вызваны повреждения, блокирующие репликацию. Затем гель-электрофорез используется для разделения восстановленной ДНК в зависимости от размера.

Затем дорожки вырезаются и переливаются горизонтально во второй гель, который дополнительно разделяет ДНК в зависимости от размера и формы. Наконец, южный анализ используется для визуализации структур ДНК, которые связаны с репликацией фрагментов ДНК до и в разное время после введения УФ-индуцированного повреждения. В конечном счете, эта процедура может быть использована для того, чтобы показать, что неспособность обрабатывать повреждения ДНК у некоторых мутантов приводит к накоплению промежуточных продуктов репарации ДНК.

Здравствуйте, меня зовут Артур Ян. Я из лаборатории Corella в Портлендском государственном университете. Здравствуйте, меня зовут Брэнд Хе, я тоже из лаборатории Корелла.

Сегодня мы покажем вам процедуру двумерного гель-электрофореза. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения репликации ДНК и промежуточных продуктов репарации. Итак, приступим.

Чтобы начать эту процедуру, вырастите за ночь культуру кишечной палочки объемом 200 микролитров, содержащую плазмиду PBR 3 22 в бедренной среде DGC с ампициллином при температуре 37 градусов Цельсия. Использование бедренной среды DGC сводит к минимуму защиту от ультрафиолета. После ночной инкубации гранулы в клетках при 14 000 РРЦ М в течение 30 секунд.

Затем ресуспендируют клеточную гранулу в 200 микролитрах DG C в среде, в которой отсутствует ампициллин, и инокулируют. 20 мл DG C в бедре выращивают средние культуры без селекции ампициллина. В встряхивающем инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия до 600 OD 0,5, что соответствует примерно пяти умножить на 10 до восьмой клетки Рост на миллилитр без ампициллина позволяет избежать отбора против аномальных или непродуктивных репликационных промежуточных продуктов, которые могут возникать у некоторых мутантов.

Кроме того, при использовании ультрафиолетового излучения для индуцирования повреждений необходимо удалить ампициллин из среды, поскольку он сильно поглощается на этих длинах волн и экранах. Клетки уменьшают эффективную дозу ультрафиолета во время роста. Используйте фотометр UVC для определения расстояния от бактерицидной лампы мощностью 15 Вт, которая обеспечивает скорость экспозиции примерно один JUUL на квадратный метр в секунду.

Последующие шаги следует выполнять под желтым светом, так как это предотвратит фотореактивацию инверсии димеров циклобутана перина с помощью фотосвязывазы после УФ-облучения. Как только желаемая плотность клеток будет достигнута, с помощью пипетки перенесите культуру в чашку Петри диаметром 15 сантиметров на вращающейся платформе, чтобы обеспечить равномерное облучение всей клеточной популяции. Затем облучите культуры с концентрацией 50 джоулей на квадратный метр и сразу же переложите их в стерильную предварительно теплую колбу и поместите обратно в инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию.

В течение эксперимента эта доза производит в среднем один димер циклобутана перина, каждые 4,5 килооснования одноцепочечной ДНК для каждой исследуемой временной точки. Пипеткой 0,75 миллилитров аликвоты культуры в 0,75 миллилитров ледяной сетки 30. Буферная сетка 30 служит в качестве стоп-буфера, предотвращающего репликацию и репарацию эксцизионного нуклеотида.

После добавления буфера остановки образец можно держать на льду до конца временного хода. По истечении временного курса окатывают каждый образец и суспензируют гранулы. В 150 микролитрах лизиса буфер лизируют клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут без перемешивания.

Поскольку реплицирующиеся структуры с одноцепочечными областями или точками ответвлений более восприимчивы к срезанию, отрезайте наконечники пипеток лезвием бритвы, чтобы сделать рот шире и свести к минимуму усилия сдвига. В целом, пипетирование и перемешивание должны быть сведены к минимуму до тех пор, пока ДНК не будет переварена ферментами рестрикции, после лизиса добавить протеиназу К и саркас-клетки и дать возможность инкубации продолжаться в течение одного часа. Это служит для высвобождения фрагментов ДНК, связанных с белком.

Поскольку активно реплицирующаяся ДНК часто связывается с белковыми или мембранными комплексами, это способствует увеличению выхода репликационных фрагментов. Через час извлеките образцы, добавив два объема фенола к каждому образцу и осторожно перевернув пробирки в течение пяти минут. Затем добавьте два объема хлороформа, изоамила, спирта и аккуратно переверните трубки еще на пять минут.

Затем центрифугируйте образцы при 14 000 об/мин в микроцентрифуге в течение пяти минут и перенесите верхнюю водную фазу каждого образца в свежую пробирку. Затем добавьте четыре объема хлороформа ISO спирта, и снова, аккуратно переверните трубки на пять минут. Снова центрифугируйте образцы при 14 000 об/мин в течение пяти минут.

Поместите диализную мембрану на 250 миллилитров 0,1 xte в стакан и нанесите на мембрану 100 микролитров каждого образца. Дайте образцам диализироваться в течение одного часа после диализа. Поместите по 80 микролитров каждого образца в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 20 микролитров смеси ферментов.

Переваривайте образцы в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. PV 2 линеаризует плазмиду сразу после начала репликации. Перед загрузкой геля Агрос добавьте 100 микролитров хлороформа и 20 микролитров шестого красителя, содержащего бромо.

Феноловый синий и ксилол голубой в каждом образце и смеси хлороформа удалят любые оставшиеся PV, два связанных с концами ДНК. Начните двухмерный анализ геля aros с пропускания ограниченных образцов ДНК через первое измерение. Сначала загрузите маркер Lambda заднего трех размеров в первую полосу предварительно приготовленного геля 0,4%agros в одном XTBE.

Затем загрузите 40 микролитров водной фазы, содержащей загрузочный краситель, для каждого образца, пропуская дорожки, чтобы облегчить нарезку гелем. После электрофореза запустите первое измерение с напряжением один вольт на сантиметр в течение примерно 12-15 часов. Низковольтный и низкопроцентный гель AGROS служит для разделения фрагментов ДНК в первую очередь на основе размера.

После того, как первое измерение будет пройдено, используйте большой мясницкий нож, чтобы вырезать первую полосу, содержащую маркер Lambda hind hind three, и покрасьте бромидом атерия. Для второго измерения вырежьте гелевые дорожки с помощью большого мясницкого ножа, используя маркер Lambda Hind three в качестве ориентира, и отбросьте область ниже, где линеаризованная плазмида должна проходить на каждой полосе. Чтобы создать второе измерение, поместите каждый ломтик горизонтально на верхнюю часть пустой закваски для геля.

Приготовьте раствор 1% AROS в одном XTBE и охладите до 55 градусов Цельсия. После остывания влейте раствор геля, чтобы отлить второе измерение, убедившись, что срезы геля полностью покрыты. Перед заливкой геля важно убедиться, что ломтики равномерно ориентированы, а касторка выровнена.

После того, как гель схватится, запустите второе измерение, от пяти с половиной до семи часов при давлении 6,5 волс на сантиметр в электрофорезной установке, которая позволяет буферу рециркулировать высоковольтный и высокопроцентный гель Агрос эффективно разделяет фрагменты ДНК в зависимости от их формы, а также размера. Нелинейные формы медленнее проходят через второе измерение после электрофореза. Промойте гель в воде один раз, а затем дважды промойте его в 400 миллилитрах 0,25 молярной соляной кислоты в течение 15 минут с легким помешиванием.

Кислотные промывки служат для частичного разрезания молекул ДНК на более мелкие фрагменты, которые более эффективно переносятся во время южного анализа и необходимы из-за большого размера и необычной формы промежуточных продуктов репликации ДНК. Чтобы приготовить гель для щелочного переноса, еще раз промойте гель в воде, затем дважды промойте его в 400 миллилитрах 0,4 молярного гидроксида натрия в течение 30 минут. Затем ДНК в гелях переносят на мембрану с высокой связью n плюс нейлоновую мембрану с использованием нисходящей щелочной системы переноса с 0,4 молярного гидроксида натрия, как описано в письменной части данной процедуры, после чего перенос ДНК продолжается в течение 6-12 часов после переноса ДНК с зондовой гибридизацией, как указано в письменном протоколе.

После того, как мембрана будет прощупана и промыта, поместите мембрану на бумажное полотенце до тех пор, пока жидкость не исчезнет. Затем оберните мембрану полиэтиленовой пленкой из поливинилхлорида и подвергните ее воздействию экрана с фосфоскопическим тепловизором. Наконец, радиоактивность может быть визуализирована и количественно определена с помощью шторма 8 40 и связанного с ним кванта изображения.

Диаграмма схемы миграции двух переваренных плазмид PBR 3 22, наблюдаемая с помощью анализа геля 2D aros. Нереплицирующиеся линейные плазмиды работают как линейные фрагменты размером 4,4 КБ, реплицирующиеся плазмиды образуют Y-образные структуры, которые мигрируют медленнее, чем нереплицирующиеся фрагменты, из-за их большего размера и нелинейной формы. Эта миграционная структура образует дугу, которая простирается от линейной области к скважине после ультрафиолетового облучения.

Двойные Y- или X-образные молекулы наблюдаются в области конуса и мигрируют медленнее, чем дуга Y-образных молекул. Пример южного анализа 2D-геля, зондированного с мечением P 32 PBR 3 22, показан для клеток сразу после УФ-облучения и через 15 минут после УФ-облучения сразу после УФ-облучения. Примерно 1% всей плазменной ДНК может быть обнаружен в Y-дуге, когда клетки быстро растут в экспоненциальной фазе после облучения.

Наблюдается временное увеличение количества YS-форменных молекул по мере накопления заблокированных репликационных вилок в поврежденных участках. L-образные промежуточные продукты репликации также временно накапливаются, накапливаются и сохраняются до тех пор, пока не произойдет время, которое коррелирует с моментом восстановления поражений. Мы только что показали вам, как визуализировать промежуточные продукты репарации ДНК с помощью двумерного гель-электрофореза.

При выполнении этой процедуры важно помнить о силах сдвига, которые могут снизить выход продукции, и быть осторожным со всеми образцами и гелями. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.