Визуализация митохондриальной дыхательной функции использованием цитохрома C Оксидазы / сукцинатдегидрогеназы (ЦОГ / SDH) Дважды маркировки гистохимии

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить прямую визуализацию дефицита митохондриальных дыхательных ферментов в свежезамороженных срезах тканей. Это достигается путем предварительного сбора срезов криостата из интересующего органа. Вторым этапом процедуры является проведение гистохимии Кокса, за которой следует гистохимия SDH.

Наконец, срезы тканей обезвоживаются, монтируются и снимаются с крышки. В конечном счете, результаты могут показать степень митохондриальной дисфункции через количество окрашивания клеточным синим цветом. Hi.Today мы поговорим о гистохимическом методе двойного мечения Cox SCH.

И хотя этот метод может быть применен для изучения заболеваний митохондрий, он также может дать представление о старении и возрастных расстройствах. После извлечения мозга у животного, которое было принесено в жертву в соответствии с этическим разрешением, быстро заморозьте его на сухом льду. Замороженную ткань можно хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию, завернув в алюминиевую фольгу до готовности к разрезанию.

Подготовьте ткань к криосекции, поместив мозг на криостатный патрон и окружив его закладным составом. Быстро поместите патрон в криостат и соберите срезы размером 14 микрон при температуре минус 21 градус Цельсия. Разморозьте секции на предметных стеклах с помощью нагревательного блока, а затем дайте предметным стеклам высохнуть при комнатной температуре в течение одного часа.

Поместите слайды в камеру для окрашивания предметных стекол влажными бумажными полосками. Поскольку время реакции имеет важное значение в этом анализе, рекомендуется обрабатывать не более 10 предметных стекол за эксперимент под химическим колпаком. Готовят инкубационную среду, содержащую мазок и цитохром С в PBS и вихре

Быстро добавьте два микрограмма бычьих CDE в среду и хорошо перемешайте путем вортексирования. Чтобы разбить все зерна CDE, все еще работающие под капотом, нанесите от 150 до 200 микролитров инкубационной среды на каждое предметное стекло с помощью наконечника пипетки, чтобы равномерно распределить по всем секциям. Выдерживайте предметные стекла в течение 40 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Через 40 минут снимите инкубационную среду со слайдов. Каждый раз вымойте слайды четыре раза в PBS в течение 10 минут. После мытья предметных стекол верните их в камеру окрашивания предметных стекол влажными бумажными полосками, работающими под химическим колпаком.

Приготовьте раствор NBT в PBS, заботясь о защите PMS от легкого вихря, быстро нанесите от 150 до 200 микролитров раствора NBT на каждое предметное стекло с помощью наконечника пипетки, чтобы равномерно распределить его по всем секциям. Выдержите предметные стекла в течение 40 минут при температуре 37 градусов Цельсия через 40 минут, удалите излишки раствора со стекол. Каждый раз вымойте слайды четыре раза в PBS в течение 10 минут.

Обезвоживайте предметные стекла в течение двух минут каждое в следующих последовательных концентрациях этанола. 70%70%95%95% и 99,5%Наконец, оставьте 10 минут с дополнительным шагом 99,5%. Поместите предметные стекла в ксилол на 10 минут, закрепите их с помощью локальной сети и прикрепите защитные стекла.

Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи или хотя бы одного-двух часов в проветриваемом помещении. Отделы мозга от дикого типа и преждевременно стареют. МТ. Мыши-мутаторы ДНК были последовательно помечены для активности ЦОГ и СДГ.

Нормальная активность Кокса, на которую указывает темно-коричневое окрашивание, наблюдается в гиппокампе мышей дикого типа. Дефицит Кокса, на который указывает синее окрашивание, был выявлен в гиппокампе у мышей-мутаторов МТ ДНК на 12 и 46 неделе. Наблюдалось дальнейшее снижение активности Кокса к 46-недельному возрасту у мышей-мутаторов M-T-D-N-A, что свидетельствует о распространенном обострении дисфункции дыхательной цепи.

Недостаточное время инкубации (10 и 25 минут) приводило к снижению осаждения продукта реакции коричневой камни. Сокращенное время инкубации позволило сформировать конечный продукт синего форана во время инкубации SDH, что вводит в заблуждение о наличии клеток с недостатком ЦОГ. Предметные стекла во время инкубации ЦОГ также привели к неточному формированию и осаждению продукта реакции DAB.

Несмотря на то, что активность Кокса и SDH может быть индивидуально помечена, как показано здесь, последовательное мечение оказалось полезным для локализации клеток с митохондриальной дисфункцией. В качестве примера контроля специфичности активности ЦОГ и СДГ в мозге у мышей дикого типа показана негативная маркировка. Поэтому не забывайте, что работа с химическими веществами в Cox SCH с двойной маркировкой является химическим протоколом чрезвычайно опасна, и такие меры предосторожности, как ношение надлежащей лабораторной одежды и маски под химическим колпаком, а также утилизация инкубационной среды должны быть сделаны каждый раз, когда вы проводите этот анализ.