Анализ Магистральные нейронной клеточной миграции Crest с использованием модифицированного Zigmond пробирной палаты

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы оценить способность молекулы вызывать хемотаксис и другие миграционные реакции в клетках нервного гребня эксплантированного ствола. Это достигается путем выделения нервных трубок на уровне ствола длиной примерно от восьми до 15 сомитов и культивирования каждой из нервных трубок в течение ночи на отдельных покровных листках, покрытых фибронектином, чтобы обеспечить эмиграцию нервного гребня. Далее подбирается оптимальная культура нервного гребня.

Нервная трубка удаляется из культуры, а покровное стекло, содержащее культуру, устанавливается на модифицированную камеру Цигмунда таким образом, чтобы самая прямая граница культуры была параллельна вектору молекулярного градиента, который должен быть нанесен на культуру. Третий шаг заключается в создании молекулярного градиента поперек культуры, а затем в съемке миграции клеток периферического нервного гребня вдоль ранее выбранной прямой границы культуры. Заключительным этапом является отслеживание и анализ миграции клеток периферического нервного гребня, расположенных вдоль выбранной границы культуры, с помощью программного обеспечения Image J.

В конечном счете, можно определить, может ли выбранная молекула изменить направленность клетки или другие миграционные характеристики, такие как скорость, с помощью анализа полученных данных о траектории клетки. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как камерный анализ Бойдена, заключается в том, что он имеет очень низкую стоимость. Этот метод может быть использован для анализа миграции уже поляризованных клеток на периферии первичных эксплан-культур с помощью покадровой визуализации.

После инкубации птенцов в течение 56 часов при температуре 38 градусов Цельсия извлеките яйца из инкубатора, слегка опрыскайте их 70% этанолом, а затем дайте яйцам высохнуть, пока яйца высыхают. Наполните одну стерильную пластиковую чашку Петри раствором Chick ringer и простерилизуйте стеклянный лоток с помощью ультрафиолета. Наполните пятисантиметровую стеклянную чашку Петри дисплеями.

Теперь разбейте яйца в стеклянный лоток для ультрафиолетового излучения. Извлеките каждый эмбрион из желтка, сначала разрезав вокруг эмбриона кровеносные островки изогнутыми ножницами. Затем с помощью тупых щипцов возьмите эмбрион за его дополнительную эмбриональную оболочку и поместите эмбрион в подготовленную чашку Петри, содержащую колпачки.

Далее выберите около девяти эмбрионов, которые находятся между гамбургером и гамильтоном. На этапах с 15 по 17 с помощью вольфрамовой иглы отрезаются все эмбриональные ткани до клеща 10 и удаляются все эмбриональные ткани сердца, начиная примерно с пятого наиболее вновь образованного клеща. Затем обрежьте лишние эмбриональные оболочки примерно до двух миллиметров от эмбриона.

Поместите изолированные стволы эмбрионов в отсеки и инкубируйте их в течение одного часа и 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, пока стволы эмбрионов инкубируются. Подготовьте шесть покровных листов для культивирования. Во-первых, промыв их в 70% этаноле и дав им высохнуть.

Затем с помощью лабораторного маркера нарисуйте круг в центре каждого покровного листа диаметром около одного сантиметра для последующей идентификации фибринового соединительного слоя на той же лицевой стороне каждого покровного листа. Напишите асимметричное слово или символ за пределами нарисованного круга, чтобы облегчить идентификацию верхней и нижней части обложки. Теперь поместите каждую крышку в отдельную стерильную форму размером 40 на 10 миллиметров маркированной стороной вниз и дайте чашке постоять открытой под бактерицидной ультрафиолетовой лампой в течение 10 минут.

Затем нанесите 60 микролитров фибронектина на немаркированную поверхность покровного стекла в пределах одного сантиметра круга, убедившись, что вся площадь круга покрыта. Поместите посуду в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут. После инкубационного периода осторожно отсасывайте финнин из каждого покровного листка.

Далее добавьте 250 микролитров питательной среды в область, покрытую ФИ-нином. Покровное скольжение, а затем снова инкубируйте покровные слипы до тех пор, пока нервные трубки не будут изолированы. Пока крышки инкубируются, наполните пятисантиметровую стеклянную чашку Петри средним L 15.

Теперь переложите все инкубированные стволы зародышей в подготовленную чашку Петри. С помощью тонких щипцов и острых язычков и иглы препарируйте нервную трубку, аккуратно разрезая иглой по границе нервной трубки и сомиты. Снимите крышки с инкубатора.

Выберите шесть самых длинных и прямых нервных трубок, а затем с помощью наконечника микропипетки, заполненного питательной средой, перенесите по одной нервной трубке на каждую из шести покровных трубок. Убедитесь, что каждая нервная трубка находится в пределах покрытой фибронектином области соответствующего покровного стекла с помощью микропипетки, и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Далее поместите не менее двух миллилитров питательной среды без сыворотки в стерильную 15-миллилитровую центрифужную пробирку.

Оставьте теленка слегка отвинченным во время инкубации трубки на ночь при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы позволить отрегулировать pH среды. После ночного культивирования выберите три лучшие культуры клеток нервного гребня, которые имеют по крайней мере один длинный прямой край из трех культур. Выберите одну для загрузки в первую камеру и верните остальные в инкубатор для последующего использования.

Затем с помощью нашего ватного тампона нанесите тонкий ровный слой вазелина на участки, окружающие резервуары и мостик одной модифицированной камеры Зигмунда. Затем с помощью вольфрамовой иглы аккуратно извлеките нервную трубку из покровного листа, содержащего выбранную культуру клеток нервного гребня, оставив окруженные клетки нервного гребня прикрепленными к фибронектиновой оболочке. Отметьте чашку лабораторным маркером, чтобы запомнить ориентацию самой прямой границы культуры клеток нервного гребня.

Затем нанесите несколько капель предварительно инкубированной среды на мостик модифицированной камеры Цигмунда. Затем подхватите покровный лист тонкими щипцами. Промокните край защитного стекла салфеткой Кима, чтобы удалить большую часть старой питательной среды, и немедленно поместите защитное стекло на модифицированную камеру Зигмунда так, чтобы прямая граница клеток нервного гребня, которую нужно снять, была центрирована по всей длине моста и примерно перпендикулярна границе резервуара моста.

С помощью инвертированного микроскопа переместите прямую границу клетки нервного гребня в сторону ближайшего к резервуару мостика. Это позволит сдержать предполагаемый химиотерапевтический такт и более точно выровнять прямую границу клеток нейрогребня перпендикулярно границе резервуара моста. Теперь аккуратно, но надежно нажмите на крышку, вставьте вазелин, присутствующий на камере Зигмунда, убедившись, что он полностью прилегает к камере.

Затем нанесите дополнительный вазелин по краю покровного стекла, чтобы еще больше убедиться, что он будет герметичным мелко. Снова отрегулируйте угол границы клетки нервного гребня, чтобы скорректировать любое движение во время процесса потолка. Затем загрузите примерно 300 микролитров предварительно инкубированной среды в одномиллилитровый шприц.

С прикрепленной иглой 25 калибра на 1,5 дюйма. Введите в резервуар среду, которая не будет содержать химиотерапию до полного заполнения. Будьте осторожны, чтобы не образовались пузырьки в водоеме.

Затем закупорьте резервуар с двух сторон достаточным количеством вазелина перед загрузкой следующего резервуара. Теперь загрузите во второй шприц 300 микролитров предварительно инкубированной среды, содержащей желаемый химиотерапевтический такт. Затем таким же образом закачайте среду в противоположный резервуар

Опять же, тщательно запечатывая водоем вазелином. После инкубируйте загруженную камеру Зигмунда при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа до начала съемок. Затем, во время инкубации при температуре около 37 градусов Цельсия, самую прямую границу культуры клеток нервного гребня в течение трех часов с 92-м интервалом для контроля, загрузите камеры Зигмунда, содержащие каждую из двух других лучших культур клеток нервного гребня, как показано выше.

Использование соответствующих контрольных обработок для заполнения резервуаров и грунтовки моста. Используйте изображение J manual trackin plugin для отслеживания миграции клеток периферического нервного гребня вдоль прямой границы культуры. Используйте плагин инструмента хемотаксиса и миграции для анализа различных параметров полученных миграционных траекторий.

Культуры клеток нервного гребня удлиненного ствола были получены путем ночного культивирования нервных трубок, и полученные культуры клеток нервного гребня были отобраны по крайней мере с одной длинной прямой границей для экспериментов. Самая длинная прямая граница одной выбранной культуры затем располагалась перпендикулярно границе резервуара моста и, следовательно, параллельно вектору будущего приложенного градиента. Резервуар, в котором не было подозреваемого химиоаттрактанта, представленного здесь со знаком минус, был загружен первым и опечатан.

Затем другой резервуар был загружен предполагаемым химиоаттрактантом, представленным знаком плюс, и запечатанные клетки периферического нервного гребня вдоль ранее выбранной границы были визуализированы и отслежены с помощью плагина ручного отслеживания для изображения J. Многочисленные миграционные характеристики в ответ на примененный градиент могут быть оценены на основе полученных данных слежения, как показано на этом графике. Например, индекс хемотаксиса может быть получен путем деления смещения клеток по оси x на общее расстояние, на которое они мигрировали. Притягательная реакция всех отслеживаемых клеток демонстрируется показанным здесь графиком траектории клетки.

Каждая красная дорожка — это траектория клетки, которая мигрировала к резервуару, загруженному предполагаемым химиоаттрактантом. На этом рисунке значительно больше красных следов по сравнению с черными. В другом тесте была подтверждена способность модифицированной камеры Зигмунда поддерживать молекулярный градиент.

В левый резервуар был добавлен конъюгат Alexa Fluor 4 88 IGM, и интенсивность флуоресценции на мосту измерялась в разное время. Градиент сохранялся в течение как минимум 26 часов После просмотра видео вы должны хорошо понимать, как анализировать способность молекулы вызывать хемотаксис и другие миграционные свойства в культурах клеток нервного гребня эксплантированного ствола с помощью модифицированного анализа камеры Зигмунда.