Анализ Магистральные нейронной клеточной миграции Crest с использованием модифицированного Zigmond пробирной палаты

Общая цель данной процедуры заключается в оценке способности молекулы вызывать хемотаксис и другие миграционные ответы в эксплантированных клетках нейрального гребня туловища. Для этого сначала изолируют нейральные трубки на уровне туловища длиной примерно от восьми до 15 сомитов и культивируют каждую из нейральных трубок в течение ночи на отдельных покровных стеклах, покрытых фибронектином, чтобы обеспечить эмиграцию нейрального гребня. Затем выбирают оптимальную культуру нейрального гребня.

Нервную трубку извлекают из культуры, а покровное стекло с культурой помещают в модифицированную камеру Зигмунда таким образом, чтобы наиболее прямой край культуры был параллелен вектору молекулярного градиента, который будет приложен к культуре. Третьим этапом является создание молекулярного градиента через культуру с последующей видеофиксацией миграции периферических клеток нервного гребня вдоль ранее выбранного прямого края культуры. Заключительный этап заключается в отслеживании и анализе миграции периферических клеток нервного гребня, расположенных вдоль выбранного края культуры, с помощью программного обеспечения Image J.

В конечном итоге, на основании анализа полученных данных о траектории клеток можно определить, способна ли выбранная молекула изменить направленность движения клеток или другие миграционные характеристики, такие как скорость. Главным преимуществом данного метода по сравнению с существующими методами, такими как анализ в камере Бойдена, является его очень низкая стоимость. Этот метод может быть использован для анализа миграции уже поляризованных клеток на периферии культур первичных эксплантатов с помощью таймлапс-визуализации.

После инкубации куриных яиц в течение 56 часов при 38 °C извлеките их из инкубатора, слегка опрыскайте 70% ethanol и дайте им высохнуть. Наполните одну стерильную пластиковую чашку Петри раствором Рингера для цыплят и стерилизуйте стеклянный лоток с помощью УФ-излучения. Наполните стеклянную чашку Петри диаметром 5 см раствором для дисплеев.

Теперь аккуратно разбейте яйца в стекновенный лоток, стерилизованный УФ-излучением. Извлеките каждый эмбрион из желтка, сначала обрезав кровяные островки эмбриона изогнутыми ножницами. Затем с помощью тупых пинцетов захватите эмбрион за внезародышевую оболочку и перенесите его в подготовленную чашку Петри с раствором Рингера.

Затем выберите около девяти эмбрионов на стадиях от 15-й до 17-й по классификации Hamburger и Hamilton. С помощью вольфрамовой иглы отсеките все эмбриональные ткани кпереди от 10-го сомита и удалите все хордальные эмбриональные ткани, начиная примерно с пятого из наиболее недавно сформировавшихся сомитов. Затем обрежьте внезародышевые оболочки, оставив около двух миллиметров от эмбриона.

Поместите изолированные туловища эмбрионов в лунки и инкубируйте их в течение одного часа и 15 минут при 37 °C и 5% carbon dioxide. Пока туловища эмбрионов инкубируются, подготовьте шесть покровных стекол для культивирования. Сначала промойте их в 70% ethanol и дайте им высохнуть.

Затем с помощью лабораторного маркера нарисуйте в центре каждого покровного стекла круг диаметром около одного сантиметра для последующей идентификации соединительного слоя фибрина на этой же стороне каждого стекла. Снаружи нарисованного круга напишите асимметричное слово или символ, чтобы облегчить определение верхней и нижней частей покровного стекла. Теперь поместите каждое покровное стекло в отдельную стерильную чашку размером 40 на 10 миллиметров маркированной стороной вниз и оставьте чашку открытой под бактерицидной УФ-лампой на 10 минут.

Затем нанесите 60 µL фибронектина на немаркированную поверхность покровного стекла внутри круга диаметром один сантиметр, убедившись, что вся область круга покрыта. Поместите чашки в инкубатор при 37 °C на 30 минут. После завершения инкубации осторожно аспирируйте фибронектин с каждого покровного стекла.

Затем добавьте 250 µL культуральной среды на область, покрытую фибронектином. Накройте предметное стекло и повторно инкубируйте их до момента изоляции нервных трубок. Пока предметные стекла инкубируются, наполните стеклянную чашку Петри диаметром 5 см средой L 15.

Теперь перенесите все инкубированные туловища эмбрионов в подготовленную чашку Петри. Используя тонкий пинцет, острые щипцы и иглу, выделите нейральную трубку, осторожно разрезая ткань иглой вдоль границы между нейральной трубкой и сомитами. Извлеките покровные стекла из инкубатора.

Выберите шесть самых длинных и прямых нейральных трубок, затем с помощью наконечника микропипетки, заполненного культуральной средой, перенесите по одной нейральной трубке на каждое из шести покровных стекол. С помощью микропипетки убедитесь, что каждая нейральная трубка находится в области, покрытой фибронектином, на соответствующем покровном стекле, и инкубируйте их в течение ночи при 37 °C и 5% carbon dioxide. Затем поместите не менее 2 мл культуральной среды без сыворотки в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл.

Оставьте колпачок слегка приоткрытым при инкубации пробирки в течение ночи при 37 °C и 5% carbon dioxide, чтобы pH среды мог стабилизироваться. После ночного культивирования выберите три лучшие культуры клеток нервного гребня, в которых как минимум в одной из трех культур имеется хотя бы один длинный прямой край. Выберите одну культуру для загрузки в первую камеру, а остальные верните в инкубатор для последующего использования.

Затем с помощью ватной палочки нанесите тонкий равномерный слой вазелина на области вокруг резервуаров и перемычки одной модифицированной камеры Сигмунда. Далее с помощью вольфрамовой иглы осторожно извлеките нейральную трубку из покровного стекла, содержащего выбранную культуру клеток нервного гребня, оставив окружающие клетки нервного гребня прикрепленными к фибронектиновому покрытию. Отметьте чашку лабораторным маркером, чтобы запомнить ориентацию самого прямого края культуры клеток нервного гребня.

Затем нанесите несколько капель предварительно инкубированной среды на перемычку модифицированной камеры Зигмунда. Затем возьмите покровное стекло тонкими пинцетом. Промокните край покровного стекла салфеткой Kim wipe, чтобы удалить большую часть старой культуральной среды, и немедленно поместите покровное стекло на модифицированную камеру Зигмунда так, чтобы прямая граница клеток нервного гребня, которую необходимо заснять, была центрирована по длине перемычки и располагалась примерно перпендикулярно границе резервуара перемычки.

С помощью инвертированного микроскопа переместите прямую границу клеток нервного гребня к той стороне мостика, которая ближе к резервуару. Это позволит локализовать предполагаемый хемотактик и более точно выровнять прямую границу клеток нервного гребня перпендикулярно границе резервуара мостика. Теперь осторожно, но плотно прижмите покровное стекло к вазелину, находящемуся на камере Зигмунда, убедившись, что оно полностью герметично прилегает к камере.

Затем нанесите дополнительно вазелин вдоль края покровного стекла, чтобы окончательно обеспечить герметичность. Снова отрегулируйте угол границы клеток нервного гребня, чтобы компенсировать любое смещение, произошедшее в процессе закрепления «потолка». Далее наберите примерно 300 µL предварительно инкубированной среды в шприц объемом 1 мл.

Используйте прикрепленную иглу калибра 25G длиной 1,5 дюйма. Наполните резервуар, в котором не будет находиться хемоаттрактант, средой до полного заполнения. При этом будьте осторожны, чтобы в резервуаре не образовались пузырьки воздуха.

Затем перед загрузкой следующего резервуара герметизируйте обе его стороны, нанеся достаточное количество вазелина. Теперь наполните второй шприц 300 µL предварительно инкубированной среды, содержащей необходимый хемоаттрактант. После этого введите среду в противоположный резервуар аналогичным способом.

Снова осторожно загерметизируйте резервуар вазелином. Перед началом съемки инкубируйте заполненную камеру Зигмунда при 37 °C в течение одного часа. Затем, во время инкубации при температуре примерно 37 °C, в течение трех часов с интервалами в 92 секунды снимайте самый прямой край культуры клеток нервного гребня для контрольной группы; аналогично загрузите камеры Зигмунда, содержащие две другие лучшие культуры клеток нервного гребня.

Используйте соответствующие контрольные обработки для заполнения резервуаров и прайминга мостика. Используйте плагин ручного трекинга ImageJ для отслеживания миграции периферических клеток нервного гребня вдоль прямой границы культуры. Используйте плагин инструмента для анализа хемотаксиса и миграции для анализа различных параметров полученных траекторий миграции.

Культуры клеток нейрального гребня удлиненного отдела туловища подготавливали путем культивирования нервных трубок в течение ночи, после чего для экспериментов выбирали те культуры клеток нейрального гребня, которые имели по крайней мере одну длинную прямую границу. Самую длинную прямую границу выбранной культуры затем располагали перпендикулярно границе резервуара мостика и, следовательно, параллельно вектору будущего прикладываемого градиента. Резервуар, не содержащий предполагаемого хемоаттрактанта (обозначен здесь знаком «минус»), заполняли и герметизировали первым.

Затем во второй резервуар был добавлен предполагаемый хемоаттрактант, обозначенный знаком «плюс», после чего была выполнена визуализация и отслеживание периферических клеток нервного гребня вдоль ранее выбранной границы с помощью плагина manual tracking для ImageJ. На основе полученных данных трекинга, как показано на этом графике, можно оценить многочисленные характеристики миграции в ответ на созданный градиент. Например, индекс хемотаксиса можно рассчитать, разделив смещение клетки вдоль оси x на общее пройденное ею расстояние. Привлекательный ответ всех отслеживаемых клеток продемонстрирован на представленном здесь графике траекторий клеток.

Каждая красная линия представляет собой траекторию клетки, мигрировавшей к резервуару с предполагаемым хемоаттрактантом. На данном рисунке количество красных линий существенно больше, чем черных. В другом тесте была подтверждена способность модифицированной камеры Сигмунда поддерживать молекулярный градиент.

Конъюгат Alexa Fluor 4 88 IGM был добавлен в левый резервуар, после чего интенсивность флуоресценции по всей длине мостика измерялась через определенные промежутки времени. Градиент сохранялся в течение как минимум 26 часов. После просмотра видео вы должны четко понимать, как анализировать способность молекулы вызывать хемотаксис и другие миграционные формы поведения в культурах эксплантированных клеток нервного гребня туловища с использованием модифицированного метода анализа в камере Цигмунда.