Мульти Фотон время Замедленная съемка изображений для визуализации в режиме реального времени разработки: Визуализация миграции клеток нервной гребень в Zebrafish эмбриона

Общая цель многофотонной покадровой визуализации заключается в получении трехмерных изображений в реальном времени с высоким разрешением, на которых изображены мигрирующие клеточные популяции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии развития, такие как картирование путей миграции различных клеточных популяций. Основное преимущество этой методики перед традиционной конфокальной микроскопией заключается в том, что многофотонные лазеры обладают более глубоким проникновением в ткани и сниженной фототоксичностью.

Это повышает удобство использования при работе с более толстыми тканями и позволяет получать изображения в течение более длительных периодов времени. Чтобы подготовиться к сбору эмбрионов, с 15:00 до 21:00 соберите резервуары для разведения и заполните их водой обратного осмоса, или водой обратного осмоса.

Пересадите до трех самок и трех самцов в противоположные стороны разделенного аквариума. На следующее утро снимите перегородку вскоре после того, как в виварии зажгутся огни. Дайте спокойному спариванию в течение 20 минут или до тех пор, пока не будет произведено достаточное количество эмбрионов.

Эмбрионы будут находиться на дне аквариума для разведения. Когда вы увидите икру, поднимите внутренний аквариум с прорезями вместе с рыбами и быстро поместите их в чистый, прочный внешний аквариум, наполненный водой обратного осмоса. Используйте сито для сбора яиц для сбора яиц из внешнего резервуара и перенесите яйца в чашки Петри, содержащие 30 миллилитров 1X эмбриональной среды.

Инкубируйте собранные яйца при температуре 28,5 градусов по Цельсию. Для трансгенных эмбрионов, через 24 часа после оплодотворения или HPF, удалите мертвые яйцеклетки и оцените стадию развития эмбрионов. С помощью щипцов удалите хорионы из трех-четырех эмбрионов, экспрессирующих GFP.

Под рассекающим флуоресцентным стереомикроскопом со стандартным фильтром возбуждения полосы пропускания от 460 до 490 нм, проводится скрининг на GFP-положительные эмбрионы. Перенесите эти эмбрионы в отдельную чашку Петри, содержащую 30 миллилитров свежей среды для эмбрионов 1Х. После 20 HPF поместите скрининговые и дехорионированные GFP-положительные эмбрионы в 0,003% раствор PTU для подавления пигментации.

Избегайте раннего начала лечения, так как это может оказать неблагоприятное воздействие на нервный гребень и развитие нейроэпителия. Добавьте 0,4 грамма порошка агарозы LowMelt в 20 мл 1x эмбриональной среды. Нагревайте смесь в течение одной-двух минут или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и все частицы не растворятся.

Распределите примерно 1 мл раствора агарозы в свежие центрифужные пробирки объемом 1,5 мл для хранения. Чтобы установить камеру открытой ванны, нанесите небольшое количество высоковакуумной смазки на основание открытой камеры ванны. Установите круглую стеклянную крышку на основание и прикрутите верхнюю часть открытой камеры ванны к основанию до упора.

примерно 500-700 микролитров 2%-ного раствора агарозы в открытую камеру ванны до тех пор, пока основание не заполнится примерно на 3/4с. Подождите 30 секунд, чтобы агароза немного остыла без полной полимеризации, а затем перенесите один зародыш в центр основания. Под флуоресцентным стереомикроскопом используйте наконечник микропипетки объемом 10 микролитров, чтобы сориентировать эмбрион и расположить его ближе к дну агарозы, чтобы он не уплыл при добавлении среды для эмбриона.

Важным шагом является обеспечение правильного расположения эмбриона в агарозе. В этих экспериментах мы ориентируем эмбрион латерально, но эмбрион также может быть расположен так, чтобы сосредоточиться на дорсальной и вентральной областях. Следите за эмбрионом и перемещайте его до тех пор, пока агароза не застынет.

Затем с помощью переводной пипетки полностью заполните собранную открытую камеру покадровой средой для эмбрионов. После того, как вся установка будет помещена на столик микроскопа, в соответствии с текстовым протоколом, используйте пятикратный объектив для определения местоположения эмбриона. Затем вручную поднимите предметный столик в самое высокое положение и с помощью тонкой фокусировки расположите эмбрион в центре диапазона микроскопа.

Вручную опустите сцену и измените цель на 25 раз погружение в воду. Осторожно поднимите сцену, чтобы вернуть эмбрион в фокус. В программном обеспечении нажмите на режим XYTZ для получения нескольких изображений с интервалом времени или T в плоскости XY на глубине Z. Используйте эпифлуоресцентное или яркое поле, чтобы найти глубину резкости в области интереса, которая будет разграничивать z-стек.

В этих экспериментах боковой край глаза является началом z-стека. Когда вы сосредоточитесь здесь, в программном обеспечении нажмите кнопку «Начать». Сфокусировавшись вниз до средней линии эмбриона, которая является концом z-стека, нажмите кнопку «Конец».

Важным шагом является обеспечение того, чтобы шаг Z охватывал область интереса. В нашем случае мы хотим захватить ширину глаза от латерального до медиального краев. Нажмите на меню для настройки времени съемки и частоты съемки.

Для адекватного восстановления fluor4 и выживания эмбриона необходимо обеспечить соотношение не менее одного к трем между получением z-стека при включенном лазерном питании и временем восстановления при выключенном лазерном питании. При наличии подходящего времени для восстановления эмбрионов установите время между z-стеками в соответствующем окне. Затем установите общую продолжительность эксперимента в соответствующем окне.

Теперь включите настройку живого изображения, чтобы внести окончательные корректировки в настройки лазера. Настройте ползунки пропускания лазера, усиления и смещения в программном обеспечении для оптимизации флуоресцентного изображения. Кроме того, при необходимости корректируйте ориентацию эмбриона в зависимости от продолжительности эксперимента, ожидаемого роста эмбриона и так далее.

Убедитесь, что область интереса остается в кадре на протяжении всего эксперимента. Во время покадровой съемки выключите эпифлуоресцентный источник света, накройте сцену лазерным предохранителем, достаточным для защиты от фонового света, затем нажмите кнопку «Пуск». Доступ к открытой камере ванны осуществляется через раздвижные дверцы на лазерном сейфе, чтобы каждые 8-12 часов наполнять ее зародышевой средой замедленного действия.

После получения изображения откройте файлы в программном обеспечении для обработки изображений, выделите правильную серию изображений. В программном обеспечении выберите меню процесса, нажмите на 3D deconvolution и примените для деконволюции каждый z-стек. Импортируйте отдельные файлы tif в программу обработки видео, затем выберите все файлы tif и перетащите их в видеоредактор.

Отрегулируйте продолжительность каждого изображения в видео до 0,1 секунды. Наконец, экспортируйте видео в виде файла mov или mp4. С помощью многофотонной флуоресцентной визуализации можно увидеть миграционные паттерны клеток черепного нервного гребня, которые дают начало черепным структурам лица и переднему отрезку глаза в трансгенных линиях рыбок данио-рерио sox10:EGFP и foxd3:GFP.

Sox 10 положительных клеток нервного гребня в диапазоне от 12 до 30 hpf мигрируют от края нервной трубки в черепно-лицевую область. Клетки из прозенцефалона и мезенцефалона мигрируют дорсально и вентрально в развивающийся глаз, чтобы заселить периокулярный мезенцин. Как указано здесь, положительные клетки sox10 образуют лобный носовой отросток.

Клетки нервного гребня из ромбенбургального мозга мигрируют вентрально и дают начало глоточным дугам. Покадровая визуализация положительных клеток нервного гребня foxd3 в диапазоне от 30 до 60 hpf показывает, что эти клетки мигрировали между зрительной чашкой и поверхностной эктодермой, а также через глазную щель, отмеченную стрелкой, и объединились вокруг хрусталика, отмеченного звездочкой, образующей строму радужной оболочки. После освоения этой техники от начала до конца ее можно выполнить за четыре дня, если она выполнена правильно.

При попытке проведения этой процедуры важно помнить о выборе эмбрионов с высоким уровнем флуоресценции. Настройка программного обеспечения на начальном этапе может быть сложной, но как только параметры определены, дополнительные изменения, как правило, минимальны. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать многофотонную покадровую микроскопию для визуализации мигрирующих клеток в эмбрионе.