Высокая пропускная способность кристаллизации мембранных белков, используя метод липидный Bicelle

В этом видео будет продемонстрирован метод организации высокопроизводительных испытаний кристаллизации очищенных мембранных белков с использованием липических В-клеток. Сначала В-клетки получают путем смешивания липидов и детергента, в смесь В-клеток добавляют очищенный мембранный белок, а также проводят испытания кристаллизации с использованием нанолитрового роботизированного визуального контроля. Использование стандартного светового микроскопа выявляет наличие кристаллов.

После формирования кристаллы белка могут быть экстрагированы и заморожены для сбора данных и определения структуры. Основное преимущество этого метода заключается в том, что благодаря уникальному фазовому поведению В-клеток для кристаллизации можно использовать стандартное оборудование и робототехнику, имеющиеся в лаборатории. Настройка В-клеток — это очень простая техника, которая позволяет вам взять целевой мембранный белок из моющего средства и поместить его в липиновую среду.

Это дает вам совершенно новый набор условий для скрининга. Это настолько простой метод, который был успешно использован на многих мембранных белках, что просто нет причин не попробовать его. Первым этапом кристаллизации на основе В-клеток является приготовление липидной амфисмеси с образованием В-клеток.

Этот процесс требует значительных усилий и является наиболее трудоемким. Обратите внимание, что это может занять несколько часов. В-клетки могут образовываться в различных комбинациях липидных амфи и в широком диапазоне концентраций.

Рекомендуемые отправные точки см. в таблице 1 в прилагаемом письменном протоколе: начните с приготовления одного миллилитра 35% капсосмеси DMPC в соотношении 2,8 к одному моляру. Для этого нужно отвесить в пробирке 0,26 грамма DMPC и 0,09 грамма Chapo. Доведите объем до 1,0 миллилитров с помощью деионизированной воды вихревой смеси.

Затем нагрейте смесь примерно до 40 градусов Цельсия на водяной бане, пока она не станет гелеобразной. Поставьте трубку на лед. Образец снова должен стать жидким.

Затем снова сделайте вихрь в течение нескольких минут, продолжайте циклически проходить этапы нагрева, охлаждения и вихревания до полного растворения липидов. Обратите внимание, что по мере выполнения большего количества циклов смесь может стать мутной при охлаждении после завершения. Смесь будет представлять собой прозрачный гель при комнатной температуре или выше, а вязкую жидкость на льду по ячейкам можно поместить при температуре минус 20 градусов Цельсия для длительного хранения.

Затем очищенные белки встраиваются в среду В-клеток. Это простой процесс, и его следует выполнять в тот же день, что и кристаллизацию, которая показана в следующем разделе видео. Разморозьте смесь капсо-В-клеток DMPC при комнатной температуре, пока фаза не превратится в прозрачный гель.

Поместите смесь на лед, чтобы разжижать ее, а затем кратковременно сделайте ее вихрем, чтобы восстановить однородную фазу В-клеток. С этого момента смесь В-клеток и очищенный белок храните на льду. Это позволит удерживать В-клетку в жидкой фазе, что сделает ее пригодной для пипетирования.

Далее добавьте смесь В-клеток к очищенному моющему средству растворимому белку в соотношении один к четырем, объем к объему. Затем аккуратно пипеткой вверх и вниз, пока раствор не станет прозрачным и однородным. Если появились пузырьки, кратковременно раскрутите их в настольной центрифуге.

Инкубируйте смесь на льду не менее 30 минут, чтобы способствовать полному включению белка в клетки. Протеин из клеточной смеси теперь готов к испытаниям кристаллизации. Испытания кристаллизации будут продемонстрированы с использованием робота-кристаллизатора комаров.

Остудите, 96 ну В нижней плите, положив ее на лед. Пипеткой вводите белок клеточной смесью в пластину, чтобы вязкость раствора была минимальной. Держите белок клеточной смесью на льду до последнего этапа.

Используемый здесь робот имеет пять платформ. Поместите микропланшет с резервуаром на платформу три, а крышку для кристаллизации, на которую будут выдаваться капли, — на платформу пять. Затем поместите белок по клеточной пластине на платформу, ближайшую к месту дозирования.

Это гарантирует, что белок из клеточной смеси будет последним, который робот улавливает и он немедленно высвобождается. С помощью программного обеспечения робот будет набирать резервуарный раствор, за которым следует смесь белков по клеткам, и выдавать их на крышку в виде капель, чтобы предотвратить нагревание и повышенную вязкость во время дозирования. Не программируйте комара на смешивание резервуара с белком путем клеточной смеси сразу после завершения прогона.

Снимите пластину с белком клетки с инструмента и положите ее на лед. Снимите крышку с инструмента и положите ее на пластину с раствором резервуара таким образом, чтобы капли перевернулись. Инкубируйте тарелку при температуре 20 градусов Цельсия.

Обратите внимание, что другие температуры также могут быть протестированы на кристаллообразование и оптимизацию. Более высокие температуры индуцируют пластинчатую фазу, которая имеет преимущество в том, что она предварительно организует белок слоями. Можно проводить скрининг при температуре от четырех до 20 градусов по Цельсию.

Температура ниже четырех градусов Цельсия может привести к выпадению липидов в осадок в течение длительных периодов времени в первый, третий день и еженедельно после этого, оцените внешний вид и рост кристаллов с помощью стандартного светового микроскопа. Здесь показано светлопольное изображение и УФ-изображение игольчатых кристаллов, наблюдаемых только в условиях штурма. Флуоресценция кристаллов не была обнаружена, что указывает на ложное срабатывание на этом изображении.

Стержневой кристалл образовался при использовании метилпропандиола в качестве осадителя. Кристалл флуоресцирует еженедельно, что указывает на то, что он может быть белковым кристаллом, но с помощью рентгеновской дифракции было обнаружено, что он не обладает высокой устойчивостью. Здесь показан кристалл, наблюдаемый примерно через четыре недели после начала испытаний.

Сильная флуоресценция под воздействием ультрафиолетового излучения подтверждает, что это кристалл белка. Как вы смотрели на этом видео. Как только В-клетки становятся доступными, их можно смешивать непосредственно с очищенным белком, и с этого момента кристаллизация протекает почти точно так же, как стандартные протоколы на основе моющих средств.

Еще одним явным преимуществом является способность легировать В-клетки специфическими липидами в целях оптимизации. Эта техника действительно очень универсальна, и она настолько проста в использовании, что ее следует попробовать для всех проектов по кристаллизации мембранных белков.