Оценка Двумерные Кристаллизация Испытания малых мембранных белков для структурных исследований биологии электронным кристаллографии

Общей целью данной процедуры является определение наиболее оптимальных условий 2D-кристаллизации для структурного определения мембранных белков методом электронной кристаллографии. Это достигается путем использования совместимого моющего средства во время очистки для растворения белка из нативного липидного бислоя. Вторым этапом процедуры является добавление экзогенных липидов и удаление моющего средства путем диализа белковой липидной моющей смеси, в результате чего образуются 2D-кристаллы в тщательно контролируемых условиях.

Третий этап процедуры заключается в прошивании, замораживании образцов до стекловидного состояния. Заключительным этапом процедуры является сбор данных с помощью криоэм. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые позволяют определить окончательную структуру белка с помощью вычислительной обработки изображений.

Здравствуйте, я из лаборатории. Я учусь в Школе биологии в Технологическом институте Джорджии. Привет, я Тина боится.

Я из Berry Lab в школе химии и биохимии и в Schmidt Kray Lab в школе биологии в Технологическом институте Джорджии. Я Мэтт Джонсон из лаборатории Инглеборга Шмидта Кри в школе биологии Технологического института Джорджии. Сегодня мы покажем вам процедуру оценки 2D хоральных испытаний с помощью em.

Мы используем этот протокол в нашей лаборатории для определения и оптимизации условий 2D-кристаллизации. Итак, давайте начнем Чтобы начать эту процедуру, подготавливаются отрицательно окрашенные образцы на медной просвечивающей электронной микроскопии с углеродным покрытием 400 меш или сетках ПЭМ. Пипеткой наберите два микролитра образца липосомы протеи под покрытую углеродом сетку TEM и инкубируйте в течение 60 секунд.

Если образец распределяется неравномерно, осторожно проведите по нему стороной наконечника пипетки. Далее блок с края оторванным куском ватмана Номер четыре фильтровальная бумага. Это обеспечивает оптимальное удаление жидкости без чрезмерного удаления липосом, а также помогает сохранить нежную углеродную пленку.

Сразу после промокания. Нанесите два микролитра 1%-ного мочеразового ацетата через 30 секунд, промокните от края сетки. Опять же, если образец содержит высокие концентрации вязкого глицерина или сахарозы, обычно в диапазоне от 10 до 20%, несколько циклов промывки сетки буфером, свободным от глицерина или сахарозы, перед отрицательным окрашиванием могут быть полезными, чтобы обеспечить надлежащее окрашивание раствором тата писсуара.

После того, как сетки подготовлены, электронная микроскопия используется для визуализации образца при малом увеличении, чтобы оценить распределение и морфологию появления мембраны, а также общее качество сетки. Затем с помощью большого увеличения получают изображения и выполняют преобразования изображений RIA для идентификации 2D-кристаллов. Для начала низкой сетки в держателе образца электронного микроскопа, чтобы получить первое впечатление о среднем распределении мембраны, используйте промежуточное увеличение от 2000 до 10 000 раз.

Обратите внимание на степень распространения мембран, их морфологию и размер в лабораторном блокноте. Записывайте репрезентативные виды с помощью ПЗС-камеры. Затем, при необходимости, наблюдайте за образцами с малым увеличением в диапазоне примерно от 400 до 800 крат, чтобы получить обзор сеток.

Это может дать ценную информацию для оценки подготовки сетки, выявив проблемы с концентрацией образца, неравномерным распределением протеи, липосомами и частичным разрушением углеродной пленки. Определите область интереса сетки при низком или среднем увеличении. Затем используйте большое увеличение, чтобы оценить возможный порядок в разных мембранах.

Это имеет решающее значение на ранних стадиях испытаний 2D-кристаллизации. Для того, чтобы идентифицировать перспективные липосомы протеи с хорошо упорядоченными областями и проверить воспроизводимость в ходе последующих экспериментов для определения оптимальной настройки большого увеличения для скрининга 2D-кристаллов, начните с увеличения от 50 000 до 60 000 раз. В зависимости от размеров 2D-кристалла и размера элементарной ячейки, настройка большого увеличения может быть уменьшена до 30 000 или увеличена до 80 000.

Здесь, в соседнем месте по отношению к области изображения, представляющей интерес, мы расфокусируемся примерно на минус 400 нанометров или выше, если существует неопределенность относительно того, является ли область интереса действительно мембраной. Осмотрите образец на наличие кусочков углеродной пленки, слюды или других артефактов, которые можно принять за липосомы протеи. Также наблюдайте за краями, чтобы различить типичную складчатость и морфологию мембраны.

Далее осмотрите интересующую область с помощью ПЗС-камеры. При сборе ПЗС-изображения при оптимальном высоком увеличении решетка меньшего или в основном гидрофобного мембранного белка может быть не видна при визуальной оценке самого ПЗС-изображения. В этом случае для онлайн-преобразования foer или ft.

Однако, если упорядоченный массив небольшой, этот FT будет содержать значительное количество шума для улучшения отношения сигнал/шум, уменьшения размера упакованного изображения, перемещения уменьшенного прямоугольника по изображению и выполнения динамической операции, настройки гамма-функции динамического FT для оптимальной идентификации упорядоченных массивов. Слишком высокое значение гаммы может скрыть пятна из-за шума, в то время как слишком низкое значение не позволит выявить более слабые места. Можно предположить, что разрешение отрицательно окрашенных 2D-кристаллов составит примерно 15 ангстрем при DFO минус 400 нанометров.

Ожидайте определения от одного до трех порядков мест. Обратите внимание на резкость пятен и любую мозаику. Двумерные кристаллы небольшого мембранного белка массой 18 килодальтон имеют размер до нескольких микрон.

Пятна на FTS резкое и легко идентифицируемое движение живого ящика FTS показывают, что решетка сплошная без мозаики. Решетка более крупного белка с более обширным растворимым доменом может быть идентифицирована на малом экране коллекции изображений T-E-M-C-C-D и FT необходимы для получения лучшей оценки качества решетки, включая такие характеристики, как мозаичный шум в FT неупорядоченной протеи. Липосомы могут быть ошибочно приняты за слабые места, чтобы определить, являются ли пятна результатом небольших белковых 2D-кристаллов или шума.

Переместите коробку для реального фута. Если пятна исчезают сразу, это шум, но если оставить их без изменений даже на небольшой площади, вероятно, присутствуют кристаллы, поскольку кристаллы липидов имеют четкую морфологию и размеры. Эти липидные кристаллы также могут быть распознаны путем визуального осмотра изображения и определения размеров элементарных ячеек.

При первоначальных испытаниях может выпасть осадок. Контроль при большом увеличении используется для различения белковых осадков и липидных агрегатов. В случае липидных агрегатов восстановление могло бы произойти на самом деле, и следующие эксперименты потребуют только корректировки параметров, необходимых для увеличения размера мембраны и создания порядка, а не для индуцирования восстановления при 30 000-50 000 раз.

Края этих темных структур показывают, что они состоят из мембран без белка. Осадочные образцы при оптимальных условиях будут содержать большой процент 2D-кристаллов. Не стоит стремиться к однородному внешнему виду мембран, так как наиболее крупные и упорядоченные 2D-кристаллы выбираются визуально для сбора данных.

Эти типы образцов будут легко распознаны при кристаллизации, которые используются для сбора данных крио-ЭМ, чтобы получить максимальное количество изображений с высоким разрешением. Мы просто покажем вам, как проводить скрининг на 2D кристалл малых белков памяти с помощью TEM при выполнении этой процедуры. Важно помнить о тщательности, чтобы не упустить из виду многообещающие условия кристаллизации, поскольку вы уже вложили значительное количество времени и усилий до этого момента.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.