Кристаллизующихся мембранных белков для определения структуры использования липидный Мезофазы

Здравствуйте и добро пожаловать в группу мембранной структурной и функциональной биологии. Меня зовут Мартин Кэффери. В центре нашего исследования находится биологическая мембрана, схема которой показана на первом слайде, мембрана, которая окружает клетку и субклеточные органеллы, когда она присутствует, представляет собой молекулярно тонкую структуру, всего две молекулы липидов в поперечнике и усеянную белками.

Нас интересует структура и функции, применяемые как к липидам, так и к белкам. Тем не менее, для целей этой серии JO я ограничусь мембранными белками. Мы стремимся понять, как эти мембранные белки функционируют на молекулярном уровне по двум причинам.

Во-первых, это интеллектуальное удовлетворение от знания того, как что-то работает. Во-вторых, зная, как он работает, так же, как ваш велосипед или автомобиль, есть перспектива починить его в случае неисправности. Разработка лекарственного препарата является очевидным результатом такого рода работ.

Подход, который мы используем, чтобы выяснить, как мембранный белок работает на молекулярном уровне, заключается в определении его кристаллографической структуры. Это включает в себя определение местоположения в трехмерном пространстве всех атомов или, по крайней мере, всех неводородных атомов, составляющих белок. Метод, который мы используем для этой цели, сокращенно называется высокомолекулярной рентгеновской кристаллографией MX.

Здесь мы видим пример мембранного белка, структура которого была определена с помощью MX при фракции качественного кристалла белка, необходимого для производства MX. Как вы можете себе представить, структурированное определение с использованием макромолекулярной кристаллографии включает в себя множество этапов. Здесь. Как правило, они включают в себя идентификацию мембранной белковой мишени, а затем ее получение, очистку и кристаллизацию.

Дифракционные измерения выполняются на кристалле с помощью домашнего или синхротронного источника рентгеновского излучения. Данные дифракции обрабатываются, получая карту электронной плотности, которая затем подгоняется к молекулярной модели. После уточнения модель может быть использована для изучения механизма действия белка и для разработки лекарств на основе структуры.

В центре внимания этой статьи - показать вам, как мы получаем кристаллы мембранных белков фракционного качества с использованием липидных мезофаз так называемым мезометодом. Недавний обзор метода и его сферы применения доступен в первой ссылке. Пошаговый протокол, которому мы будем следовать, описан в виде блок-схемы, обобщающей этапы и время, необходимое для организации испытания кристаллизации конечного мезомембранного белка.

В этом видео описаны те шаги, которые заключены в пунктирные красные линии. Здесь показаны элементы, которые вам нужно будет сделать в мезокристаллизации в ручном режиме. Они включают в себя концентрированный раствор очищенного мембранного белка липида для создания хозяйки, обычно моноол, чтобы сделать липид более заметным.

В этом видео он был легирован растворами красного красителя, устройствами для петтинга очищенных водопроводных труб и одноразовыми наконечниками, а также ассортиментом плотно прилегающих шприцев Hamilton, некоторые со съемными иглами, узкой муфтой, используемой для смешивания белкового раствора с липидами для производства мази. Повторяющийся дозатор от стеклянного микроскопа Hamilton застегивает предметные стекла и крышки. Идеально изолированная перфорированная двухстиковая распорная лента для хорошего создания пинцета, сколотых ледяных тканей, калькулятора и, самое главное, вашего лабораторного блокнота.

Следующая процедура используется для приготовления стеклянной сэндвич-кристаллизационной пластины. Для загрузки поместите на скамью разрозненное предметное стекло микроскопа. Снимите защитный бумажный чехол с одной поверхности полосы перфорированной двойной распорной ленты.

Поместите ленту липкой стороной вниз в соприкосновение с поверхностью горки под давлением. Приклейте ленту к предметному стеклу. С помощью брайера или ролика между лентой и роликом можно поместить алюминиевую фольгу для защиты основания колодцев.

Снимите вторую бумажную крышку с ленты, чтобы обнажить ее верхнюю липкую поверхность. В результате этой процедуры создается стеклянная пластина, готовая к нагрузке, и последующий потолок, как только погрузка будет завершена. Индивидуальная разрозненная крышка скользит в непосредственной близости от плиты для быстрого и эффективного потолка скважин.

Поместите липид в блок с регулируемой температурой при температуре 45 градусов Цельсия на три минуты, чтобы он расплавился. Обратите внимание, что используемый липид обычно является моноландом. В этом видео липид имеет красный краситель, добавленный для видимости во время таяния липидов.

Подготовьте два газоплотных шприца Hamilton объемом 100 микролитров для использования На этапе смешивания липидного белка удалите тефлоновое масло меха из шприца, который будет содержать белковый раствор. Поместите рядом со шприцем, который будет удерживать липид. В этом случае фал оставляют на месте.

Поместите узкую муфту между двумя шприцами, а затем подсоедините муфту к пальцу липидного шприца. Затяните муфту со шприцем, но не перетягивайте. Извлеките поршень из цилиндра липидного шприца.

Убедитесь, что липид расплавлен. Установите дозатор на 30 микролитров и медленно наберите 30 микролитров расплавленного липидного колпачка. Липидный флакон.

Липид должен храниться под азотом или аргоном при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Медленно подайте как можно больше расплавленного липида в открытый конец шприца. Следите за тем, чтобы не было воздушных зазоров.

Поместите поршень в бочку, контактирующую с расплавленным леопардом, и медленно продвигайте поршень вверх по бочке, держа шприц вертикально. Как показано, захваченный пузырь воздуха случайно поднимается в процессе и высвобождается. Теперь у нас есть пробка из расплавленных липидов в бочке, объем которой вы должны точно определить.

Это можно сделать, прочитав маркировку на цилиндре шприца. В этом случае объем составляет 23 микролитра, что записывается в лабораторную тетрадь. Наденьте мех на иглу, выходящую из стяжки.

Используйте поршень, чтобы протолкнуть расплавленный липид вверх по цилиндру и медленно и осторожно ввести иглу в сердцевине муфты. Если игла немного переполнена, будет видно, как липид бьется на ее открытом конце. Слегка отступив назад поршень, избыток липида может быть затянут в муфту до тех пор, пока он не окажется на одном уровне с кончиком иглы муфты.

В этом случае узел сцепки шприца полностью загружен и готов к совмещению с белковым шприцем. Раствор следует вращать при 14 000 G в течение 10 минут, от пяти до 10 минут при четырех градусах Цельсия для удаления крупных агрегатов. Прежде чем проводить испытания кристаллизации, возьмите белковый раствор из ведра со льдом и уравновесьте его при комнатной температуре.

Рассчитайте объем белка, чтобы раствор использовать для формирования кубической фазы при или близкой к полной гидратации для олеана при температуре 20 градусов Цельсия. Полная гидратация водой происходит при почти 40% от веса воды, как показано на фазовой диаграмме. Напомним, что мы загрузили в липидный шприц 23 миллиграмма моно при плотности 0,94 миллиграмм на микролитр.

Это соответствует 21,6 миллиграммам липидов, таким образом, нужно 21,6 умножить на четыре или 14,4 миллиграмма или 14,4 микролитра белкового раствора с помощью шприца Гамильтона объемом 25 или 50 микролитров, набрать необходимый объем белкового раствора, перенести раствор на тефлоновый наконечник поршня в бочке с белковым раствором. Следя за тем, чтобы не было пузырьков воздуха, осторожно извлеките иглу и измерьте объем белкового раствора в шприце. Оно должно совпадать со значением, предоставленным на предыдущем шаге.

При подготовке к совмещению с липидным шприцем. Осторожно внесите белковый раствор вверх по бочке, чтобы в конечном итоге он оказался на одном уровне с ее открытым концом. Это можно увидеть, посмотрев вниз через конец заделки ствола.

Раствор липинового белка, загруженные шприцы теперь готовы к объединению, чтобы подготовиться к этому, вкрутите белковый шприц в открытый конец муфты, прикрепленной к липидному шприцу. Соединив два шприца посредством муфты. Должен существовать непрерывный объем жидкости от липидов в одном шприце через ответвитель до белкового раствора в другом шприце

При подготовке к смешиванию собранный блок удерживается в одном шприце в правой руке, а другой в левой. Крутящий момент прикладывается к обоим цилиндрам до муфты, используя пальцы и большой палец обеих рук, чтобы гарантировать, что уплотнение борозд в муфте остается неповрежденным при затяжке. Собранное смесительное устройство на этом этапе повредит ALS и вызовет утечку при затяжке, что также приведет к утечке.

Это вопрос опыта с неизбежными пробами и ошибками, а иногда и потерей образца. Поэтому стоит попрактиковаться с липидами и водой или буферным раствором, чтобы прочувствовать систему, прежде чем приступать к использованию ценного белкового раствора для влияния на смешивание, продвигайте поршень на белковой стороне собранного смесительного узла до предела, большим или указательным пальцем прогоняя белковый раствор из белкового шприца через соединитель в липидный шприц. Если узел был эффективно герметизирован, это действие вызовет равномерное и противоположное движение поршня на липидной стороне.

Поршень на липидной стороне теперь используется для проталкивания содержимого липидного шприца обратно через колер в белковый шприц. Этот процесс повторяется много раз. Иногда требуется сотня пассажей или больше, чтобы получить однородную фазу миса.

В начале смешивания движение материала вперед и назад через муфту может быть неравномерным, и иногда для перемешивания требуется дополнительное усилие. Этого и следовало ожидать. Первоначальное перемешивание обычно сопровождается развитием неравномерного помутнения в образце и вновь ожидается.

По мере прогрессирования гомогенизации. Текстура, ощущаемая силой, необходимой для перемещения поршней вперед и назад, становится более однородной и характерной для вискус-кубической фазы, как и внешний вид возникающей кубической фазы. Если условия подходящие и образуется кубическая фаза, дисперсия должна казаться оптически прозрачной в цилиндре шприца.

Таким образом, маркировка на корпусе шприца должна быть четко различима через мезофазу в цилиндре. В случае цветных белков мезофаза будет иметь цвет белка, но будет оптически прозрачной. Очень незначительное охлаждение образца во время смешивания путем помещения шприцевого смесителя на короткое время на лед может ускорить гомогенизацию и достижение прозрачности.

Тем не менее, важно не переусердствовать с образцом, следует соблюдать осторожность, чтобы избежать слишком энергичного перемешивания, так как это может привести к повышению температуры образца из-за фрикционного нагрева. На этом этапе формируется кубическая миса-фаза, и белок восстанавливается в липидный слой. Теперь миза-фаза готова к дозированию в отдельные лунки кристаллизационных пластин

Однако сначала мезофаза должна быть передана в шприц Hamilton объемом 10 микролитров, установленный на многозарядном дозаторе. Начните этот процесс с тонкого подсоединения шприца к дозатору. Зарядите шприц кубической жидкостью.

Извлеките иглу и поршень из шприца. Оставьте тефлоновую фал на месте. Снимите стопорную гайку с дозатора с помощью мелкой монеты.

При этом храповой рычаг полностью отведен. Введите шприц без поршня и иглы через удерживающее кольцо дозатора. Установите на место уплотнительную прокладку узла стороной к шприцу и плотно вкрутите его на открытый конец шприца.

Следует следить за тем, чтобы шприц был правильно отцентрирован в удерживающем кольце и что ствол был выровнен параллельно рычагу храпового механизма. Оба эти требования важны, потому что если поршень не работает свободно и сквозное давление в исходном шприце во время нагрузки может произойти утечка. Проденьте поршень через зажимное кольцо с помощью гайки захвата, открутите несколько оборотов и направьте поршень в открытый конец шприца.

Нажмите на храповой рычаг, полностью переместите поршень в бочку и проверьте, чтобы он свободно проходил и проходил в бочке. Если винт и направляющая шина были ослаблены, снова затяните его и еще раз проверьте, чтобы поршень двигался свободно. I дозирующий шприц теперь готов к загрузке.

Переместите поршень с одной стороны собранного смесительного узла до нулевой отметки градуировки в микролитре. Перенести мезофазу на другой шприц и ответвитель. Отсоедините пустой шприц с установленным UL от смесительного узла и немедленно подсоедините загруженный шприц с муфтой, прикрепленной к резьбовому концу дозирующего шприца объемом 10 микролитров.

Степень герметичности, с которой выполняется сцепление, имеет решающее значение. Как уже отмечалось, загружают дозирующий шприц, нажимая на поршень шприца объемом 100 мкл так, чтобы мезофаза передавалась через муфту. Если муфта плотно затянута и поршень в дозирующем шприце работает свободно, то поршень должен начать движение в направлении движения загрузочного плунжера по мере наполнения дозирующего шприца.

Отсоедините загрузочный шприц с муфтой, прикрепленной к дозирующему шприцу. Прикрепите короткую иглу с плоским наконечником к стальному концу дозирующего шприца и осторожно затяните его на месте. Зажмите поршень на рычаге трещотки, затянув узел в зажимном кольце.

Следует следить за тем, чтобы не перетянуть узел. Так как это может повредить и деформировать поршень, что сделает его непригодным для использования. Важно, чтобы диапазон хода, предоставляемый храповому рычагу в зажатом состоянии, был ограничен не более дюйма.

Как показано выше, поршень будет иметь тенденцию к деформации, и доставка может не сработать. L несколько раз нажмите на храповой барабан, чтобы продвинуть поршень в бочке, тем самым заполнив пустой объем иглы и загрузив иглу. Этот шаг следует повторять до 10 раз до тех пор, пока из кончика иглы не выйдет непрерывная нить фазы мезы

Теперь игла готова к использованию при проведении испытаний по кристаллизации, которые должны начаться немедленно. Не рекомендуется хранить наполненную белком кубическую фазу слишком долго перед началом испытаний кристаллизации. Поскольку некоторые белки нестабильны в кубической фазе без добавления осадка, поместите многолуночную кристаллизационную пластину и защитное стекло на поверхность, приподнятую на несколько дюймов над уступом для удобства загрузки.

Оптимальный контраст и улучшенная видимость достигаются при слегка темной поверхности. Гомогенизируйте растворы осадителя и раскройте флаконы. Установите дозатор осадка на один микролитр, держа дозирующий шприц вертикально в одной руке, свободной рукой расположите кончик иглы в центре и прямо над основанием лунки.

Номер один. Нажмите кнопку на диспенсе на повторяющемся дозаторе, чтобы вытолкнуть комок мизы на стеклянную поверхность. Объем болюса составляет 200 нанолитров.

При использовании стандартного повторяющегося дозатора со шприцем объемом 10 микролитров кончик иглы должен находиться не более чем на несколько сотен микрометров выше основания лунки. Просто нужно немного попрактиковаться. После того, как четыре соседние лунки будут загружены меазой, налейте по одному микролитру раствора осадка поверх каждого болюса мизы.

Используя два микролитра в соответствии с патентом и стандартные одноразовые наконечники как можно быстрее, поместите крышку прямо на заполненные лунки, чтобы равномерно покрыть их и обеспечить водонепроницаемое уплотнение. С помощью шпателя надавите на защитное стекло в том месте, где оно соприкасается с открытой липкой поверхностью распорной ленты. Процесс дозирования мази и осадка можно повторять до тех пор, пока все лунки на пластине не будут загружены и запечатаны.

Теперь планшет готов к осмотру и инкубации. Четко обозначьте табличку для отслеживания. С светочувствительными белками обычно обрабатывают пластины алюминиевой фольгой перед помещением их в инкубационную камеру.

Их можно удалить и рассмотреть под микроскопом в приглушенном или соответствующим образом окрашенном свете. Поместите пластины в камеру с регулируемой температурой, обычно при температуре 20 градусов Цельсия или около того, по обычному графику. Осмотрите стенки на предмет роста кристаллов с помощью поляризационного светового микроскопа с 10 или 20-кратным сопротивлением.

Цель, расписание, используемое в авторской лаборатории, следующее: день 0 1 2 3 5 7 14 21 30 пост. Внимательно осмотрите комок мизы. Регулировка глубины резкости в пределах образца толщиной 140 микрон.

Обследование следует проводить как при нормальном освещении, так и между перекрестно скрещенными поляризаторами, бесцветными мембранными белковыми кристаллами, растущими в кубической фазе при наблюдении при нормальном освещении. Выглядите вот так. Бесцветные кристаллы мембранных белков, растущие в мезо, при наблюдении в поляризованном свете выглядят так-то или так-то, естественно окрашенные мембранные белки, растущие в мезо, при наблюдении при нормальном освещении выглядят так-то или так-то.

Следующими шагами в общем процессе структурированного определения являются сбор и криогенное охлаждение кристаллов, а также регистрация и обработка рентгеновской дифракции от них. Эти темы рассматриваются в отдельных статьях JoVE этой серии.