Использование робота для высокой пропускной кристаллизации мембранных белков в липидный Мезофазы

Здравствуйте и добро пожаловать в группу мембранной структурной и функциональной биологии. Меня зовут Мартин Кэффери. Это еще одна статья из серии статей о кристаллизации мембранных белков для структурированного определения с использованием метода в мезо- или липической кубической фазе.

В первой статье, JoVE 1 7 1 2, мы продемонстрировали, как готовится кубическая фаза, насыщенная белком, и как вязкая и липкая миза-фаза вручную распределяется в стеклянные сэндвич-пластины для испытаний кристаллизации. В этой видеостатье будут описаны методы использования робота для мезокристаллизации. Робот обладает такими преимуществами, как скорость, точность, миниатюризация и способность работать в течение длительного времени в некомфортных условиях, например, в темноте или при низких температурах.

При правильном использовании роботы могут значительно повысить продуктивность исследования структуры и функции мембранного белка. В этой видеостатье мы продемонстрируем использование трех коммерчески доступных роботов. Первый робот был разработан в группе мембранной структурной и функциональной биологии и подробно описан в первой ссылке.

Два других стали доступны совсем недавно и включены здесь для полноты картины. Подготовка кристаллизационной пластины для проведения испытания кристаллизации роботизированным способом начинается с подготовки опорной пластины стеклянного многослойного кристаллизационного планшета, подробно описанного в отношении опорной пластины, которая должна быть сначала изолирована, и на пластину должна быть нанесена перфорированная двойная прокладка, которая создает лунки. Необходимые для этого материалы показаны здесь.

Они включают в себя стеклянную кристаллизационную подставку, перфорированный раствор для распорки с двумя палочками, валик или бумажные салфетки Брайера и стакан с водой UE. Тарелку кладут на бумажное полотенце на столешницу. Несколько капель бесшумного раствора наносятся, а затем равномерно распределяются по поверхности пластины бумажной салфеткой.

Пластину промывают от излишков избытка раствора путем полного погружения ее в стакан с водой. Тарелку снимают с стакана, положив на сухое бумажное полотенце. Силосной стороной вверх и его открытая поверхность высушивают, слегка протирая бумажными полотенцами.

Далее снимается защитная крышка на перфорированной двойной прокладке и дистанционная рамка прикладывается к разрозненной поверхности стеклянной пластины. Важно, чтобы распорка была правильно расположена на опорной пластине так, чтобы верхний левый угол и две смежные стороны проставки и пластины совпадали. Ролик или брайер используется для выравнивания прокладки на опорной плите и создания плотного уплотнения между ними.

В скобках отметим, что разрозненные пластины в комплекте с перфорированными прокладками доступны в продаже, как описано в справочном разделе. После подготовки кристаллизационной опорной плиты мы переходим к настройке и использованию мезоробота. Как будет отмечено ниже, мы продемонстрируем использование трех в мезороботах.

Во всех показанных случаях роботы были настроены и использованы в помещении с контролируемой температурой, установленной на уровне 20 градусов Цельсия в мезороботе, первом в мезороботе, который будет продемонстрирован в этом видео. Статья была разработана в лаборатории PI и в настоящее время доступна в продаже. Полную информацию можно найти в справочном разделе.

Здесь показаны материалы и оборудование, необходимые для организации испытания кристаллизации с помощью робота. Они включают в себя лабораторную тетрадь, насыщенную белком кашу, свежеприготовленную, как описано в Джо статьи 1 7 1 2 и помещенную в шприц Гамильтона. Разрозненные опорные пластины с распорками и подходящим защитным стеклом, бутылкой для воды и салфетками, а также роботом in miso.

Первый вид — это робот со свободной палубой. Следующий вид — робот в комплекте со станцией парка увлажнителей, опорной плитой кристаллизации и блоком глубоких скважин, содержащим растворы осадка. Мы начинаем настройку с размещения опорной плиты на палубе робота.

Он имеет собственную платформу, четко обозначенную хорошо расположенными местами для выравнивания опорной плиты. Табличка должна иметь четкую маркировку в целях идентификации. Блок из 96 лунок, содержащий растворы осадков, закреплен на собственной платформе на палубе робота рядом с кристаллизационной пластиной.

Блок открывается путем осторожного снятия пластикового потолочного колпачка. Поток влаги из увлажнителя направляется на опорную плиту на палубе робота и через нее Настройка робота. Робот инициализируется в соответствии с инструкциями производителя.

Мы не будем здесь подробно демонстрировать это, потому что точные протоколы со временем будут меняться. По существу, во время инициализации происходит следующее: дозирующий манипулятор на роботе снабжен опорными позициями в трех ортогональных направлениях: x, Y и Z. Далее, насыщенная белком меза-фаза в шприце Гамильтона в комплекте с дозирующей иглой прикрепляется к одному из роботов. Теперь кончик иглы дозирующего шприца должен быть выровнен по дну и центру самой верхней лунки в левом углу кристаллизационной пластины. Это соответствует тому, что идентификатор скважины A one выравнивается по дну скважины A one в качестве первого порядка выполнения задач.

Это делается путем регулировки высоты или координаты Z после дозирующего рычага, наблюдая за тем, насколько близко кончик иглы подходит ко дну лунки. О том, что наконечник просто касается дна лунки, можно судить, перемещая пластину вручную из стороны в сторону на платформе, при этом слегка регулируя высоту дозирующего рычага, Z-координата дозирующего рычага, где наконечник соприкасается с пластиной, вводится в компьютерную дозировку, запрограммирована на то, чтобы происходить с кончиком иглы в нескольких микрометрах от этого эталонного Z-положения. который соответствует поверхности опорной плиты. Затем робот активируется для выполнения ряда шагов, предложенных пользователем, чтобы расположить кончик иглы в центре колодца А.

Опорная координата XY дозирующего рычага, в котором центрирован наконечник, хранится в компьютере, управляющем роботом. Он используется для определения центра остальных лунок на пластине. Установив эти опорные координаты в компьютере, дозатор mease получает команду вернуться в исходное положение, заправив шприц.

Теперь дозирующий шприц должен быть заправлен. Это делается для того, чтобы свежая маза заполнила дозирующую иглу и чтобы первая лунка на тарелке получила полный набор мамеса. В программе есть команда прайминга, которая запускает активацию робота.

Он заставляет поршень в шприце ступенчато продвигаться вперед под контролем пользователя. В то время как это происходит, кончик иглы осматривают на предмет появления мизы, экструдированную фазу мезы удаляют с помощью салфетки. На этом процесс заправки завершается запуском робота.

Теперь робот готов к запуску в автоматическом режиме, начав пробег. Программа робота XAP инициирует цикл этапов промывки, во время которых наконечники для дозирования осадка на двух рукавах робота промываются и подготавливаются к отсасыванию растворов осадка из блока глубоких скважин, активируя функцию дозирования на роботе, приводит в движение, последовательная загрузка лунок с белком в первые восемь лунок за раз. с последующими осадительными растворами между поставками. Дозирующий кронштейн возвращается в парковочное положение, где конец иглы помещается в увлажненную губку, чтобы предотвратить высыхание кончика иглы.

Чаще всего значения, используемые в испытаниях кристаллизации, проводятся в мембране. Группа структурной и функциональной биологии составляет 50 нанолитров мази и 800 нанолитров осадочного раствора. Программа, запускающая робота в этой демонстрации, была настроена таким образом, что две руки движутся одновременно.

Таким образом, можно завершить загрузку 96-луночного планшета с мякотью и осадителем за пять минут. Пластина немедленно заполняется, и руки робота возвращаются на свои парковочные места. Пластина снимается с палубы робота и размещается на ровной твердой поверхности.

Покровное стекло аккуратно укладывается сверху на опорную плиту, соприкасающуюся с верхней липкой поверхностью дистанционной рамки. Важно убедиться, что все 96 лунок полностью закрыты, что защитное стекло выровнено по отношению к опорной плите и что ни одно из защитных стекол не выходит за пределы опорной плиты. Ролик или брайер используется для создания плотного и равномерного уплотнения между покровным стеклом и распоркой.

На этом этапе пластину следует осмотреть, чтобы убедиться, что настройка прошла должным образом. То, что вы ищете, это жареное яйцо на сковороде. В каждой лунке ярмо яйца соответствует фазе меза.

Белок яйца – это раствор осадка, а край кастрюли – периметр кристаллизации. Ну, в идеале, эти три должны быть концентрическими. Теперь планшет готов к размещению в хранилище с контролируемой температурой для выращивания кристаллов.

Если пластины больше не должны устанавливаться, блок осадителя следует снять с палубы робота, должным образом запечатать и вернуть на хранение. Шприц, содержащий мазу, извлекается из дозирующей руки робота, демонтируются его различные части, в том числе дозирующая игла и ферила. Тщательно промытый метанолом и высушенный при подготовке к следующему использованию В мезороботе два комара LCP.

В следующем видеоклипе показан робот LCP от комаров, который может быть использован в испытаниях мезокристаллизации. Он включает в себя систему дозирования MEPH-фазы, аналогичную описанной ранее в этой статье. Однако для первого робота осадок дозируется с помощью одноразовых наконечников.

Сам инструмент показан здесь. Он включает в себя деку, на которой кристаллизационная пластина и блок осадителя устанавливают камеру с окнами для контроля влажности. На этом снимке из окон на камеру влажности были открыты катушка с дозирующими наконечниками, дозирующий кронштейн mease, лазерный датчик для определения местоположения иглы дозирования meph-фазы.

Приподнятая платформа, на которой находится кристаллизационная пластина, утопленная платформа для удержания блока сита осадителя. В этой последовательности робот выполняет инициализирующую последовательность действий при включении прибора. Программное обеспечение используется для настройки прибора для работы с определенными кристаллизационными пластинами и блоками осадка, а также для дозирования заданных объемов мази и осадка в заданной последовательности.

Такие данные предоставлены производителем и не будут здесь показаны. Использование робота для установки кристаллизационной пластины начинается следующим образом: шприц Гамильтона в комплекте с иглой и наполненный белковой смесью готовят, как описано выше в мезороботе 1 и в Jo 1 7 1 2. Шприц зажимается в положении под дозирующим рычагом робота.

Координаты X и Y иглы на дозирующем шприце устанавливаются с помощью лазерного датчика, установленного на палубе. Это важный шаг, который необходим для того, чтобы обеспечить точное дозирование мази в центре каждой лунки на кристаллизационной пластине. Одним нажатием кнопки на панели управления шприц подготавливается для удаления слизи с кончика иглы.

Затем экструдированная маза удаляется вместе с салфеткой в рамках подготовки к использованию робота для загрузки скважин перед установкой кристаллизационной пластины на палубу робота. Поверхность платформы увлажняется несколькими каплями воды, чтобы удерживать плиту на месте. С помощью капилляра с пластины снимается защитный чехол и пластина прочно устанавливается на ее платформу для обеспечения хорошего сцепления.

На платформе есть три реперных рычага, над которыми центрируются три угловых лунки, вскоре для обеспечения правильного позиционирования пластины по отношению к кончику дозирующей иглы, теперь инструмент готов к вступлению в цикл настройки. Это начинается со второго этапа грунтовки, когда Mease выливается на небольшую стеклянную пластину непосредственно перед тем, как перейти к загрузке пластины свежей Mease. В этой последовательности мы видим, как робот сначала загружает mease вертикальной колонной из восьми лунок на пластину, а затем с помощью одноразовых наконечников дозирует раствор осадка поверх mease bolus.

Этот процесс повторяется 11 раз по длине пластины до тех пор, пока все лунки не будут заполнены. Весь процесс занимает около пяти минут. В этом конкретном видео в каждую лунку было введено по 50 нанолитров Mease и 800 нанолитров раствора осадка.

Заполненная пластина снимается с платформы робота, размещенного на скамейке. На него надевается защитное стекло, и пластина закрывается бюстгальтером, как описано выше в разделе «Мисо робот». Правильно маркированная пластина теперь может быть помещена в среду с контролируемой температурой для роста кристаллов в мезороботе номер три, Griffin LCP.

В этом заключительном видеоклипе показан робот Griffin LCP в использовании в испытаниях мезокристаллизации. Griffin включает в себя систему дозирования фазы Meph, аналогичную описанной выше для робота-один. В этом случае, однако, все 96 растворов осадителя дозируются одновременно.

Сам инструмент показан здесь. Он включает в себя деку, на которой расположены кристаллизационная пластина и блок осадителя, дозирующий рычаг для миза и наконечник Phoenix 96. Для дозирования осадочных растворов робот в действии показан в этом заключительном видеоряду.

Головка с наконечником 96 сначала загружается раствором осадителя. Для облегчения аспирации вязких осадков предусмотрена заданная пользователем задержка. Фаза MEA последовательно распределяется в 96 лунок в процессе, который занимает около одной минуты.

Наконец, наконечник 96 дозирует все 96 осадочных растворов одновременно на вершину болюсов фазы MEA в кристаллизационных лунках. Весь процесс загрузки пластин завершается за две минуты. Заполненная пластина снимается с деки робота, а пластина запечатывается покровным стеклом и помещается на хранение в контролируемых температурных условиях для роста кристаллов.

Следующими шагами в общем процессе структурного определения с помощью макромолекулярной кристаллографии являются сбор и криогенное охлаждение кристаллов, а также регистрация и обработка рентгеновской дифракции от них. Эти темы рассматриваются в отдельных статьях о вакансиях этой серии.