Использование робота для высокой пропускной кристаллизации мембранных белков в липидный Мезофазы

Здравствуйте и добро пожаловать в группу структурной и функциональной биологии мембран. Меня зовут Мартин Каффери. Это следующая статья из серии материалов JoVE по кристаллизации мембранных белков для структурного определения с использованием метода in meso или липидной кубической фазы.

В первой статье, JoVE 1 7 1 2, мы продемонстрировали способ приготовления кубической фазы, насыщенной белком, а также метод ручного дозирования вязкой и липкой фазы misa в стеклянные сэндвич-пластины для проведения экспериментов по кристаллизации. В данной видеостатье будут описаны методы использования робота для кристаллизации in meso. Робот обеспечивает такие преимущества, как скорость, точность, прецизионная миниатюризация и возможность длительной работы в неблагоприятных условиях, например, в темноте или при низких температурах.

Правильное использование робототехники может значительно повысить продуктивность исследований структуры и функций мембранных белков. В данной видеостатье мы демонстрируем использование трех имеющихся в продаже роботов. Первый робот был разработан в группе структурной и функциональной биологии мембран и подробно описан в источнике один.

Два других стали доступны совсем недавно и включены здесь для полноты описания. Подготовка планшета для кристаллизации с целью проведения роботизированного скрининга начинается с подготовки базовой пластины стеклянного сэндвич-планшета для кристаллизации, подробно описанного в ссылке; сначала базовую пластину необходимо силилизировать, а затем на нее нужно нанести перфорированный двухсторонний клейкий спейсер, который формирует лунки. Необходимые для этого материалы показаны здесь.

Они включают стеклянную пластину для кристаллизации, перфорированный двойной разделитель, раствор для осаждения, ролик или бравьер, бумажные салфетки и стакан с деионизированной водой. Пластина помещается на бумажное полотенце на лабораторный стол. Наносят несколько капель раствора, который затем равномерно распределяют по поверхности пластины с помощью бумажной салфетки.

Пластину промывают от избытка силилизирующего раствора, полностью погружая ее в стакан с водой. Пластину извлекают из стакана и кладут на сухое бумажное полотенце силилизированной стороной вверх, после чего открытую поверхность просушивают, осторожно промакивая бумажными полотенцами.

Затем защитный слой с перфорированного двойного клейкого разделителя снимают, и разделитель приклеивают к силиконизированной поверхности стеклянной пластины. Важно правильно расположить разделитель на базовой пластине так, чтобы верхний левый угол и две прилегающие стороны разделителя и пластины совпадали. Для плотного прилегания разделителя к базовой пластине и создания герметичного соединения используют ролик или брейер.

Примечаем, что планшеты с разделителями (siloized plates), укомплектованные перфорированными проставками, доступны в коммерческой продаже, как описано в разделе литературы. После подготовки базового планшета для кристаллизации мы переходим к настройке и использованию робота для in meso кристаллизации. Далее мы продемонстрируем работу трех роботов для in meso кристаллизации.

Во всех представленных случаях роботы установлены и используются в помещении с регулируемым температурным режимом, поддерживаемым на уровне 20 °C. Meso Robot One, первый робот серии meso, продемонстрированный в данном видео, был разработан в лаборатории главного исследователя и в настоящее время доступен в коммерческой продаже. Подробная информация приведена в разделе литературы.

Здесь представлены материалы и оборудование, необходимые для роботизированной постановки опыта по кристаллизации. В их число входят лабораторный журнал, белковый раствор, свежеприготовленный согласно описанию в статье Jo 1 7 1 2 и помещенный в шприц Hamilton, силиконизированные базовые планшеты с разделителями и соответствующими покровными стеклами, бутылка с водой и салфетки, а также робот in miso.

На первом виде представлен робот с пустой рабочей платформой. На следующем виде показан робот, полностью укомплектованный станцией увлажнения, базовой пластиной для кристаллизации и блоком глубоких лунок с растворами осадителя. Мы начинаем настройку с размещения базовой пластины на платформе робота.

Он имеет собственную платформу с четко обозначенными позициями лунок для выравнивания базовой пластины. Пластина должна быть четко промаркирована для идентификации. Блок на 96 лунок с растворами осадителя закреплен на собственной платформе на рабочей поверхности робота рядом с кристаллизационной пластиной.

Блок открывают, аккуратно сняв пластиковую верхнюю крышку. Поток влажного воздуха из увлажнителя направляют так, чтобы он проходил над базовой пластиной на платформе робота при его настройке. Инициализация робота проводится в соответствии с инструкциями производителя.

Мы не будем подробно демонстрировать этот процесс, так как точные протоколы со временем меняются. По сути, во время инициализации дозирующий манипулятор робота получает опорные координаты в трех ортогональных направлениях: x, Y и Z. Затем к первому манипулятору робота прикрепляется шприц Hamilton с дозирующей иглой, содержащий мезофазу с белком; подробные инструкции по подготовке мезофазы и шприца приведены в статье JoVE 1712 и в источнике 1. Теперь кончик иглы дозирующего шприца должен быть совмещен с дном и центром верхней лунки в левом верхнем углу кристаллизационной планшеты. В первую очередь это соответствует совмещению с дном лунки под идентификатором A1.

Это выполняется путем регулировки высоты или координаты Z дозирующего манипулятора с одновременным наблюдением за тем, насколько близко кончик иглы подходит к дну лунки. Тот факт, что кончик едва касается дна лунки, можно определить, перемещая планшет вручную из стороны в сторону на платформе и очень осторожно регулируя высоту дозирующего манипулятора. Координата Z манипулятора, при которой кончик касается планшета, вводится в компьютер; дозирование программируется таким образом, чтобы кончик иглы находился в нескольких микрометрах от этой эталонной позиции Z, соответствующей поверхности базового планшета. Затем активируется робот, который выполняет серию шагов по запросу пользователя для позиционирования кончика иглы в центре лунки A1.

Эталонные координаты XY дозирующего манипулятора, в которых центрирован наконечник, хранятся в компьютере, управляющем роботом. Они используются для определения центров остальных лунок на планшете. После установки этих эталонных координат в компьютере манипулятор для дозирования реагентов переводится в исходное положение для подготовки шприца.

Теперь необходимо заполнить шприц-дозатор. Это делается для того, чтобы свежий раствор mease заполнил дозирующую иглу и первая лунка планшета получила полный объем mease. В программе управления роботом предусмотрена команда на заполнение.

Это позволяет поршню в шприце продвигаться ступенчато под контролем пользователя. В процессе выполнения этой операции кончик иглы проверяют на наличие выходящей фазы мениска; выделившуюся фазу мениска удаляют салфеткой. На этом завершается процесс подготовки системы перед запуском робота.

Теперь робот готов к запуску в автоматическом режиме. Программа Robot XAP инициирует серию этапов промывки, при которых наконечники для дозирования осадителя на втором манипуляторе робота промываются и подготавливаются к аспирации растворов осадителя из блока с глубокими лунками. Активация функции дозирования робота запускает последовательную загрузку лунок сначала белком, по восемь лунок за раз, с последующим добавлением растворов осадителя между итерациями. Манипулятор для дозирования белка возвращается в исходное положение, где кончик иглы помещается в увлажненную губку, чтобы предотвратить высыхание белка на кончике.

Чаще всего при проведении экспериментов по кристаллизации в группе структурной и функциональной биологии используются такие значения, как 50 nanoliters белка и 800 nanoliters раствора осадителя. Программа управления роботом в данной демонстрации настроена таким образом, чтобы оба манипулятора перемещались одновременно.

Таким образом, заполнение 96-луночного планшета белком и осадителем можно завершить за пять минут. Сразу после заполнения планшета и возврата манипуляторов робота в исходное положение планшет снимают с платформы робота и помещают на ровную твердую поверхность.

Стеклопокрышка аккуратно укладывается на базовую пластину так, чтобы она соприкасалась с верхней липкой поверхностью прокладки. Важно убедиться, что все 96 лунок полностью закрыты, что стеклопокрышка выровнена параллельно краям базовой пластины и не выступает за ее границы. Для создания плотного и равномерного уплотнения между стеклопокрышкой и прокладкой используется ролик или брайер.

На этом этапе необходимо осмотреть планшет, чтобы убедиться в правильности проведения процедуры. Следует добиться внешнего вида, напоминающего «глазунью» на сковороде. В каждой лунке «желток» яйца соответствует мезофазе.

Яичный белок служит осаждающим раствором, а край сковороды — периметром кристаллизации. В идеале все три элемента должны быть концентрическими. Теперь планшет готов к помещению в зону хранения с контролируемой температурой для выращивания кристаллов.

Если подготовка дополнительных планшетов не требуется, блок осадителя следует снять с платформы робота, плотно закрыть и убрать на хранение. Шприц с реагентом снимают с дозирующего плеча робота и разбирают на отдельные части, включая дозирующую иглу и феррулу. Детали тщательно промывают метанолом и высушивают для подготовки к следующему использованию в роботе Meso LCP.

В следующем видеоролике показан робот mosquito LCP, который можно использовать для постановки экспериментов по кристаллизации в мезофазе. В нем реализована система дозирования мезофазы, аналогичная той, что была описана ранее в этой статье. Однако в первом роботе осадитель дозируется с использованием одноразовых наконечников.

На данном изображении представлен сам прибор. Он включает в себя платформу, на которой размещаются планшет для кристаллизации и блок преципитанта, а также камеру с окнами для контроля влажности. На данном ракурсе окна камеры влажности открыты; видны катушка с дозирующими наконечниками, дозирующий рычаг и лазерный датчик для определения положения иглы дозирования фазы меф.

Приподнятая платформа, на которой располагается планшет для кристаллизации, и углубленная платформа для размещения блока с экраном осадителей. В данной последовательности робот выполняет инициализирующую серию действий при включении прибора. Специальное программное обеспечение используется для настройки прибора для работы с конкретными планшетами для кристаллизации и блоками осадителей, а также для дозирования заданных объемов раствора и осадителя в определенной последовательности.

Такие подробности предоставляются производителем и здесь не приводятся. Подготовка планшета для кристаллизации с помощью робота начинается следующим образом: шприц Hamilton с иглой, заполненный белком в среде, подготавливается так, как описано выше в разделе «робот для методов in meso» и в JoVE 1 7 1 2. Шприц закрепляется в соответствующем положении под дозирующим рычагом робота.

Координаты x и y иглы дозирующего шприца определяются с помощью установленного на платформе лазерного датчика. Это важный этап, необходимый для обеспечения точного дозирования mease в центр каждой лунки кристаллизационной планшеты. Нажатием кнопки на панели управления шприц приводится в готовность к вытеснению mease из кончика иглы.

Затем излишки смазки удаляют салфеткой, подготавливая робота к заполнению лунок перед установкой планшета для кристаллизации на платформу робота. Поверхность платформы увлажняют несколькими каплями воды, чтобы зафиксировать планшет. С помощью капилляра с планшета снимают защитную крышку, после чего планшет плотно устанавливают на платформу для обеспечения надежной фиксации.

На платформе расположены три реперных метки, по которым центрируются три угловые лунки; это обеспечивает правильное позиционирование планшета относительно наконечника дозирующей иглы, после чего прибор готов к запуску цикла настройки. Процесс начинается со второго этапа промывки, при котором раствор Mease дозируется на небольшую стеклянную пластину непосредственно перед загрузкой свежего Mease в планшет. В данной последовательности действий робот сначала заполняет Mease вертикальный столбец из восьми лунок планшета, а затем с помощью одноразовых наконечников дозирует раствор-осадитель поверх болуса Mease.

Этот процесс повторяют 11 раз вдоль всего планшета, пока не будут заполнены все лунки. Весь процесс занимает около пяти минут. В данном конкретном видео в каждую лунку было внесено 50 нанолитров Mease и 800 нанолитров осадительного раствора.

Заполненный планшет снимают с платформы робота, установленного на лабораторном столе. Накладывают покровное стекло и герметизируют планшет с помощью зажима, как описано выше в разделе «Meso Robot 1». Надлежащим образом маркированный планшет теперь можно поместить в среду с контролируемой температурой для выращивания кристаллов в «Meso Robot 3» — системе Griffin LCP.

В этом заключительном видеоклипе показана работа робота Griffin LCP при подготовке экспериментов по кристаллизации in meso. Робот Griffin оснащен системой дозирования мезофазы, аналогичной той, что была описана выше для первого робота. Однако в данном случае все 96 растворов осадителя дозируются одновременно.

На данном изображении показан сам прибор. Он состоит из платформы, на которой расположены планшет для кристаллизации и блок с высаливателями, дозирующего рычага и головки Phoenix 96 с наконечниками. В этой заключительной видеопоследовательности показана работа робота по дозированию растворов высаливателей.

Сначала в головку с 96 наконечниками загружается раствор осадителя. Предусмотрена настраиваемая задержка для облегчения аспирации вязких осадителей. Фаза MEA последовательно распределяется по 96 лункам; весь процесс занимает около одной минуты.

Наконец, головка с 96 наконечниками одновременно дозирует все 96 растворов осадителя поверх капель фазы MEA в лунках для кристаллизации. Весь процесс заполнения планшета занимает две минуты. Заполненный планшет снимают с платформы робота, герметизируют покровным стеклом и помещают в хранилище при контролируемом температурном режиме для роста кристаллов.

Следующими этапами общего процесса определения структуры методом макромолекулярной кристаллографии являются сбор и криозамораживание кристаллов, а также запись и обработка полученных от них данных рентгеновской дифракции. Эти темы рассматриваются в отдельных статьях данной серии.