От конструктов в кристаллах - в сторону структуры Определение β-ствольных белки наружной мембраны

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы получить миллиграммовые количества бета-бочек на внешней мембране, которые будут кристаллизоваться и разрушаться. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сворачивания и транспортировки мембранных белков, например, как белки бета-бочек встраиваются в клеточные мембраны. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она устойчива к бета-бочковым белкам.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что выбор моющих средств для очистки, кристаллизации и дефракции является сложной задачей. Джереми Герин, постдок из лаборатории Сьюзан Бьюкенен, продемонстрирует эту процедуру, в дополнение ко мне и моим коллегам по лаборатории. Начните эту процедуру с создания вектора экспрессии T7, содержащего оптимизированный для кодона внешний мембранный белок-мишень, или ген OMP, для экспрессии in vivo на мембране, как описано в текстовом протоколе.

Преобразуйте конструкцию в экспрессирующий штамм бактерий для экспрессии, пипетируя один микролитр плазмиды в 50 микролитры химически компетентных клеток BL21(DE3), и осторожно перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Выдерживать на льду в течение 30 минут. После инкубации нагрейте при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 секунд с помощью водяной бани, а затем снова положите на лед на одну минуту.

Добавьте один миллилитр предварительно подогретого фильтрующего материала SOC и встряхивайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа со скоростью 1000 об/мин с помощью настольного шейкера-инкубатора. После инкубации поместите 100 микролитров клеток на планшеты LB Agar, содержащие соответствующий антибиотик, и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия, перевернутые в обратном виде. Затем проведите небольшие тесты экспрессии, инокулируя пять миллилитров LB, содержащую культуру антибиотиков, в одну колонию.

Повторите для пяти-10 колоний. Растите при 37 градусах Цельсия с встряхиванием до оптической плотности на 600 нанометров примерно нуля целых шесть десятых. Индуцируйте экспрессию целевого ОМП, добавив пять микролитров одного молярного IPTG в каждую культуральную пробирку и дайте возможность вырастить еще один-два часа.

Чтобы сравнить уровни экспрессии для всех колоний, центрифугируйте по одному миллилитру каждой культуры в течение одной минуты при 15 000 G с помощью микроцентрифуги. Удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте ячейки в 200 микролитрах загрузочного буфера 1X SDS-PAGE. Нагрейте до 100 градусов Цельсия в течение пяти минут, а затем снова центрифугируйте при 15 000 G в течение пяти минут.

Анализируйте образцы с помощью SDS-PAGE, пипетируя по 20 микролитров в каждую лунку десятипроцентного геля. Запустите гель в течение 35 минут при постоянном напряжении 200 вольт. Наконец, соберите клетки центрифугированием при 6000 G в течение десяти минут.

Ресуспендируйте клетки в буфере для лизиса в соотношении пять миллилитров на грамм клеточной пасты. Лизируйте клетки с помощью френч-пресса или гомогенизатора клеток. Затем вращайте лизированные клетки при температуре 15 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить нелизированные клетки и клеточный мусор.

Переложите надосадочную жидкость в чистую пробирку и снова центрифугируйте на высокой скорости в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Полученная гранула представляет собой мембранную фракцию, содержащую интересующий белок. С помощью гомогенизатора Dounce ресуспендируйте мембранную фракцию.

Сначала перенесите мембраны, а затем добавьте солюбизационный буфер в концентрации 2X без моющего средства. Залейте ресуспендированные мембраны в градуированный цилиндр и добавьте воду до тех пор, пока не будет достигнута конечная концентрация 1X солюбизационного буфера. Переложите образец в стакан и медленно добавляйте моющее средство до конечной концентрации, примерно в 10 раз превышающей критическую концентрацию мицелл.

Затем перемешивайте от 0,5 до 16 часов при температуре четыре градуса Цельсия, в зависимости от того, насколько легко целевой белок извлекается из мембран. Наконец, центрифугируйте растворенный образец при 300 000 G в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Подготовьте колонку IMAC объемом от одного до пяти миллилитров или используйте предварительно упакованную колонку.

Выполняйте последующие этапы хроматографии при четырех градусах Цельсия. Промойте водой, чтобы удалить следы консервантов. Если используется автоматизированная система очистки, установите колонку в соответствии с инструкциями производителя.

Приготовьте 500 миллилитров IMAC буфера А без имидизола и 250 миллилитров IMAC буфера В с одним моляром имидизолом. Уравновесьте колонку IMAC с помощью 10 объемов колонки буфера IMAC A. Добавьте имидизол в образец белка до конечной концентрации 25 миллимоляров и перемешайте. Затем загрузите образец в уравновешенную колонку IMAC со скоростью два миллилитра в минуту.

Соберите протекание. Далее промыть колонку IMAC пятью объемами колонок с возрастающей концентрацией имидизола в каждой, используя буфер В. Соберите смывки в две миллилитровые фракции. Элюируйте образец с конечной концентрацией 250 миллимоляров в течение пяти объемов колонки и соберите элюированный образец в двух миллилитровых фракциях.

Анализируйте протекающие, промывные фракции и фракции элюирования с помощью анализа SDS-PAGE на основе их поглощения на глубине 280 нанометров. Объедините фракции, содержащие целевую бета-бочку OMP, проверенную с помощью анализа SDS-PAGE. Затем удалите метку 6X гистадина, добавив протеазу TEV в объединенный образец и инкубируя в течение ночи при четырех градусах Цельсия с легким покачиванием.

Снова загрузите раствор протеазы образца в колонку IMAC, чтобы отделить целевую бета-бочку OMP от отщепленных меток и любого неиспользованного образца. Проточный канал будет содержать расколотый образец, на котором отсутствует бирка. Чтобы подготовиться к кристаллизации, загрузите образец на гелевую фильтрационную колонну в буфер, содержащий моющее средство, которое будет использоваться для кристаллизации.

Соберите доли в одном миллилитре и проанализируйте с помощью анализа SDS-PAGE на основе их поглощения на 280 нанометрах. Объедините те фракции, которые содержат целевой белок, а затем сконцентрируйте примерно до 10 миллиграммов на миллилитр. Перед подготовкой образцов соберите гелевый аппарат.

Используйте предварительно охлажденный гель в буфере для бега или запустите гель в холодильной камере. Отфильтруйте образец с помощью центробежного фильтра 0,22 микрона для удаления твердых частиц и осадков. Затем пипеткой наберите 0,25 микролитра образца в две микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров

Пометьте одну как «кипяченую», а другую как RT»Затем добавьте 9,75 микролитров буфера для образцов в каждую пробирку и перемешайте с помощью пипетирования. В оба образца также добавьте 10 микролитров загрузочного буфера 2X SDS и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования. Кипяченый образец прокипятить при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, при этом оставить образец RT при комнатной температуре.

Затем коротко покрутите отварной образец. Далее загрузите по 20 микролитров обоих образцов на предварительно собранный нативный гель. После запуска геля в течение 60 минут при постоянном напряжении 150 вольт снимите гель и замочите в растворе для окрашивания, чтобы визуализировать результаты.

Проведите испытания кристаллизации в детергентной, биклеточной и липидной кубической фазе с использованием ранее опубликованных методов Юпитера. Кристаллизационные головки визуализируются под ультрафиолетовым микроскопом, чтобы убедиться, что кристаллы действительно являются белком, а не растворенными, липидами или моющими средствами. Кристаллы свинца проверяются с помощью домашнего источника или на синхротроне, чтобы увидеть, разрушаются ли кристаллы.

После сбора данных о кристаллах, которые хорошо разрушаются, обработайте данные с помощью программного обеспечения для обработки, такого как HKL2000. Переносите полученные файлы в программный пакет для определения структуры, такой как Phoenix Suit, и выполняйте молекулярную замену для начальной фазировки и определения структуры. С помощью этого метода была определена кристаллическая структура YIUR с разрешением 2,6 Ангстрема.

После освоения эту технику можно сделать за две недели, если ее правильно выполнить. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как экспрессировать и очищать бактериальные белки внешней мембраны для структурных исследований.