Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии

Общая цель данного эксперимента заключается в количественном измерении миграции клеток в режиме реального времени с помощью видеопокадровой микроскопии. Это достигается путем предварительного покрытия коллагеном шестилуночной культуральной пластины, а затем незначительного засеивания представляющих интерес клеток на покрытую пластину. В качестве второго шага с помощью наконечника пипетки в планшете создается рана, обеспечивающая достаточное пространство для миграции.

Затем настраивается микроскоп и через равные промежутки времени делаются снимки с использованием системы контроля температуры, что позволяет непрерывно наблюдать за мигрирующими клетками в режиме реального времени. В конечном счете, протокол отслеживания частиц используется для оценки различий в средней скорости и общем смещении тестовых и контрольных ячеек. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как анализ миграции в камере избегания, заключается в том, что он не основан на количественных измерениях миграции конечных точек.

Вместо этого он позволяет непрерывно отслеживать и рассчитывать различные параметры. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии рака, например, как определенные гены или лекарства влияют на миграцию опухолевых клеток? За два дня до процедуры добавьте по 1,5 миллилитра коллагена, разведенного в opti media, в каждую лунку шестилуночного планшета для культивирования, а затем инкубируйте планшет в течение ночи при четырех градусах Цельсия за сутки до процедуры.

Ресуспендируйте интересующие клетки в двух миллилитрах DMEM плюс FBS на лунку и перенесите клетки в каждую лунку пластины, покрытой коллагеновым покрытием ENC, инкубируя клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. В день проведения процедуры. Используйте наконечник для пипетки, чтобы создать рану в культивируемых клетках за ночь, и промойте каждую лунку PBS, чтобы удалить любой мусор, образовавшийся в результате раны.

Добавьте DMEM плюс FBS в промытые лунки, а затем проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что образовалось чистое раневое пространство. После включения камеры микроскопа и аппарата для визуализации живых клеток расположите пластину над предметным столиком микроскопа. Закройте пластину новой камерой контроля окружающей среды с живыми клетками и установите термостат на 37 градусов Цельсия и углекислый газ на 5%.

Выберите управление фокусировкой, нажав F в круге кнопки. В окне набора фильтров выберите настройки, чтобы направить путь света на I элемент. Выберите подходящий фильтр для Яркого освещения поля, а затем нажмите на кнопку Открыть Яркость.

Чтобы открыть затвор светлого поля. Теперь выберите фильтр яркого поля на револьверной головке и просмотрите образец через окуляр, чтобы найти подходящие поля и сфокусировать образец. Затем переместите революцию фильтра, чтобы изменить путь света к камере Для захвата изображения в программном обеспечении для слайдбука нажмите на управление фокусировкой, выберите XY, чтобы выбрать различные положения через I-образную часть, а затем нажмите «Установить», чтобы зафиксировать в каждом месте.

Для захвата изображения вручную настройте фокус изображения камеры, которое просматривается на экране, а затем используйте инструменты в окне управления фокусом для настройки положения области по оси Z. Для достижения наилучших результатов сосредоточьтесь на плоских ячеистых выступах вблизи контакта с пластиной, чтобы облегчить фокусировку. Используйте ползунок, чтобы отрегулировать время экспозиции в подходящем диапазоне для фокусировки.

Если выбрано несколько положений XY, отрегулируйте фокус для каждого отдельного положения, выбрав управление фокусировкой. Затем xy, затем точка посещения. В альбоме слайдов выберите графику камеры в строке меню, выберите тип съемки, а затем выполните интервальную съемку, чтобы выбрать продолжительность эксперимента.

В раскрывающемся меню введите желаемую задержку между началом одной временной точки и началом следующей. В полях интервала третье поле будет автоматически вычисляться из введенных вручную значений. В разделе Захват нескольких XY выберите многоточечный список для экспериментов с более чем одним положением XY.

Наконец, назовите файл, чтобы сохранить файл, перейдите в раздел «Управление захватом» и выберите «Дополнительно», затем спулируйте. Затем захватите в память и сохраните в буферный файл после каждой временной точки. Начните с клика по изображению.

В строке меню слайдбука выберите импорт из раскрывающегося меню, а затем нажмите на катушку слайдбука. Выберите нужные файлы сборника слайдов, созданные в ходе эксперимента по миграции, для различных полей и временных точек. Откройте первый файл, затем выберите маску в строке меню и выберите протокол отслеживания частиц из выпадающего меню.

В меню отслеживания частиц выберите протокол ручного отслеживания частиц. Появится окно с точками времени начала и окончания Чтобы проанализировать случайную миграцию, выберите маску, а затем протокол отслеживания частиц. Опять же, чтобы определить координаты для центра объекта, выберите центр области.

Затем нажмите «Отслеживать» и продолжите. Теперь выберите желаемую статистику для каждого пути, такую как смещение и средняя скорость. Как показано здесь, нажмите Рассчитать, чтобы просмотреть статистику.

В этом окне показан пример анализа случайной миграции, количественно выраженного в терминах скорости. На графике Вискерса в этом эксперименте наблюдалось увеличение средней скорости в клетках M-D-A-M-B 2 31 с сбитым геном-супрессором опухолей. По сравнению с контрольной клеткой M-D-A-M-B 2 31 здесь случайная миграция клеток с первого рисунка анализировалась с точки зрения смещения клеток.

Опять же, в группе полного нокдауна гена-супрессора опухоли наблюдалось повышенное смещение клеток по сравнению с контрольной группой M-D-A-M-B 2 31. Клетки в этой покадровой видеомикроскопии фильма контроля MDA MB 2 31 клетки были усажены на коллаген на ночь. Затем изображения были сделаны с интервалом в один час в общей сложности 18 часов во время случайной миграции.

Обратите внимание, как клетки со временем удаляются от своих исходных положений. В этом фильме была зафиксирована и проанализирована миграция тестовых клеток M-D-A-M-B 2 31 после ночного посева на коллаген. Обратите внимание, что тестовые клетки более мигрируют по сравнению с контрольными клетками в предыдущем фильме.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как клеточная инвазия и dynas, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какова роль клеток в метастазировании рака после его развития? Этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии к изучению миграции клеток с использованием изолированных линий раковых клеток.