Мультиплексное количественное обнаружение бактерий с использованием магнитных микросфер, меченных красителями

Возьмите пробную пластину, содержащую смесь микросфер магнитного полистирола, окрашенных изнутри спектрально разными флуорофорами.

Каждый набор микросфер ковалентно связан с различными антителами захвата, специфичными для патогенных бактерий.

Добавьте убитую теплом смесь патогенных бактерий. Инкубировать.

Антитела захвата связываются с целевыми бактериальными антигенами, образуя комплексы микросфера-бактерия.

Используйте магнитный сепаратор для осаждения комплексов. Выбросьте несвязанные бактерии и промойте с помощью буфера.

Добавьте буфер и биотинилированные антитела для обнаружения, которые специфически связываются с бактериями, связанными с микросферами.

Магнитно отделите комплексы и промойте с буфером.

Восстановите суспендию комплексов в буфере. Репортерные молекулы пипетки, содержащие стрептавидин с флуорофорной связью, которые связываются с биотинилированными детектирующими антителами.

Магнитно отделите и промойте комплексы. Снова приостановка в буфере.

Во время анализа на основе потока первый лазер возбуждает внутренние флуорофоры микросферы, генерируя уникальные спектральные сигнатуры и идентифицируя уникальные наборы микросфер.

Второй лазер возбуждает флуорофорные репортеры, связанные с бактериями на микросферах, количественно оценивая бактерии на различных наборах микросфер, что позволяет многократно количественно обнаруживать бактерии.

Для захвата образца начните с добавления пятидесяти микролитров микросфер или шариков, конъюгированных для захвата антител, в 96-луночный планшет. Затем добавьте пятьдесят микролитров патогенных бактерий, а затем пятьдесят микролитров PBS-TBN в фоновые лунки.

Накройте пластину пломбой из фольги и выдерживайте на вибростенде при восьмистах оборотах в минуту в течение часа.

После этого поместите пластину на магнитный сепаратор на 1 минуту, чтобы отделить шарики. Откачайте оставшийся раствор, удерживая пластину на магнитном сепараторе пластин. Затем постучите по лабораторным бумажным полотенцам три-четыре раза. Тщательно промойте лунки PBS-TBN дважды.

Для обнаружения образца добавьте в лунки пятьдесят микролитров буфера для анализа, а затем пятьдесят микролитров биотинилированного антитела для обнаружения в концентрации четыре микрограмма на миллилитр.

Инкубируйте планшет в темноте в течение часа, чтобы обеспечить эффективное взаимодействие между бактериями и антителами. Затем отделите валики с помощью магнитного сепаратора и промойте бусины PBS-TBN, как было показано ранее.

Суспендируйте шарики в пятидесяти микролитрах буфера для анализа и добавьте пятьдесят микролитров стрептавидин-R-фикоэритрина или SAPE, флуоресцентной репортерной молекулы. Накройте тарелку пломбой из фольги и выдержите в шейкере в течение 30 минут.

После того, как лунки будут промыты, повторно суспендируйте шарики в 100 микролитрах PBS-TBN и загрузите пластину на проточный анализатор.

Запишите показания с помощью соответствующего программного обеспечения. Чистые медианные значения интенсивности флуоресценции для каждого организма могут быть оценены с помощью стандартной кривой для определения бактериальной нагрузки, присутствующей в образце.