Высокое разрешение изображений Онлайн-клеточной поведения в развивающихся нейроэпителия

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы визуализировать поведение клеток в эмбриональной нервной трубке с высоким разрешением в течение длительных периодов времени. Это достигается путем предварительного пересечения ранней нервной трубки конструкцией, управляющей экспрессией флуоресцентного белка по выбору для маркировки отдельных клеток. Следующий шаг – сделать ломтики раннего эмбриона и закрепить их на стеклянных донных посудах.

После восстановления в инкубаторе срезы эмбриона через равные промежутки времени визуализируются на широкопольном микроскопе. В конечном счете, этот метод может быть использован для изучения поведения клеток в развивающемся нейроэпителии в течение длительных периодов времени с высоким пространственным и временным разрешением. Основное преимущество этой методики перед существующими методами визуализации живых тканей заключается в том, что она позволяет наблюдать за поведением отдельных клеток в течение длительных периодов времени с высоким пространственным и временным разрешением.

Этот метод позволяет решить ключевые вопросы в области нейробиологии развития, такие как роль ориентации митотического веретена в выборе сульфата или как сигнальная динамика может регулировать поведение клеток до электропорации плазмид в нервную трубку. Стеклянные иглы подготавливают с помощью микрокапиллярного пуллера под препарирующим микроскопом. С помощью тонких щипцов отломите кончик иглы.

Конец иглы должен быть достаточно острым, чтобы проткнуть нервную трубку, и в то же время не настолько узким, чтобы препятствовать введению раствора ДНК. X для этого эксперимента инкубировали при 37 градусах Цельсия в течение примерно 36 часов, чтобы приготовить гамбургер Hamilton. Этап 10.

Чтобы начать эту процедуру, поместите окно и яйцеклетку и поместите электроды на расстоянии пяти миллиметров друг от друга по обе стороны от эмбриона, введите ДНК в нервную трубку. ДНК окрашивается небольшим количеством быстрого зеленого цвета для визуализации. Подайте ток напряжением от 12 до 17 вольт и длиной импульса 50 миллисекунд три раза с интервалом 950 миллисекунд между импульсами.

Низкие концентрации ДНК и низкие напряжения электропорации используются для достижения мозаичной экспрессии, чтобы можно было следить за отдельными клетками. Наконец, закройте окно в яичной скорлупе подвальной лентой, убедившись, что оно герметично. Дайте эмбрионам восстановиться в течение трех-четырех часов или в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию.

Смесь коллагена и питательная среда для срезов должны быть приготовлены примерно за час до нарезки эмбрионов. Приготовить коллагеновую смесь из расчета 100 микролитров 0,1% раствора уксусной кислоты на 300 микролитров коллагена первого типа и тщательно перемешать, добавить 100 микролитров пятикратного L 15, срединно и тщательно перемешать. Опять же, раствор должен стать желтым.

Далее добавьте от 15 до 20 микролитров 7,5%-ного бикарбоната натрия и тщательно перемешайте. Раствор должен стать слегка розовым. Держите на льду.

Эту коллагеновую смесь следует каждый раз готовить свежей. Для приготовления питательной среды для срезов в дозе до 10 миллилитров нейробазальной среды, добавки В 27 glut max и раствора гентамицина, поместите среду в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия, буферизованный 5% углекислым газом. Оставьте верхнюю часть контейнера свободной, чтобы она могла уравновеситься с углекислым газом не менее часа.

Чтобы начать эту процедуру, с помощью маленьких ножниц вырежьте эмбрион. Извлеките зародыш из яйца с помощью пинцета, промывающего л 15 средних. Поместите эмбрион в чашку для культивирования тканей со слоем силгарда на дне.

Проведите эмбрион через окружающие дополнительные эмбриональные оболочки так, чтобы оболочки были натянуты. С помощью микроножа разрежьте эмбрион как можно прямее через интересующую область. Для срезов спинного мозга срезы должны составлять от одного до двух сомитов толстых срезов листьев, прикрепленных к боковой ткани эмбриона, чтобы они не были потеряны во время срезания других эмбрионов.

Для переноса срезов спинного мозга на стеклянную донную тарелку необходим индивидуальный микроперпет. Чтобы приготовить это, прикрепите кончик объемом 200 микролитров к перману P 2 или P 10 и отрежьте примерно один миллиметр от конца кончика. Закодируйте внутреннюю часть наконечника коллагеном, приготовив один микролитр коллагеновой смеси, которая была приготовлена ранее.

Оставьте на одну-две минуты, а затем смойте L 15 medium. Это предотвратит прилипание ткани к внутренней стороне кончика. Теперь отделите ломтик от зародыша с помощью микроножа и извлеките ломтик из чашки с помощью P two или P 10 с наконечником объемом 200 микролитров.

Старайтесь брать как можно меньше носителей. Смешайте коллагеновую смесь и капните от пяти до восьми микролитров ее на стеклянную посуду, покрытую полиоллизином и покрытую крышкой в качестве основания, немедленно поместите срез эмбриона в коллаген и расположите его с помощью пары тонких щипцов. КСЖ должны располагаться таким образом, чтобы отображаемая сторона находилась на одном уровне с защитным стеклом.

Ткань должна прилипнуть к покрытию полиоллизином на покровном листе. Повторяйте это до тех пор, пока у вас не останется несколько ломтиков на покровном листе. Обычно на одно блюдо кладут от шести до девяти ломтиков.

Когда все ломтики будут на своих местах, добавьте два-три микролитра L 15, средне до самого раннего места коллагена и накройте блюдо. Дайте коллагену застыть в течение 20 минут. После того, как коллаген будет тщательно схватываться, добавьте два миллилитра питательной среды, которая была уравновешена не менее часа в 5% углекислом газе и 37 градусах Цельсия.

Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не выбить коллаген из покровного места в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия и дать срезам восстановиться не менее трех часов перед визуализацией. Визуализация поведения клеток в тканях в течение длительных периодов времени с высоким временным и пространственным разрешением является сложной задачей. Сочетание оптимальных условий культивирования и использования белопольной микроскопии имеет важное значение для получения хороших результатов.

Широкоугольный микроскоп дельта-видения, оснащенный климатической камерой метеостанции, используется для визуализации срезов. Камера постоянно поддерживается на уровне 37 градусов Цельсия с помощью аппарата для перфузии углекислого газа для поддержания предметного столика микроскопа на уровне 5% углекислого газа и 95% Аэрографическая съемка обычно осуществляется с использованием масляного иммерсионного объектива 40 раз по 1,30 NA, и изображения захватываются с помощью ядра Snap HQ два называемых ПЗС-камерой Z Срезы захватываются каждые 1,5 микрона через 45 микрон воздействия на ткани. Время должно быть как можно меньше, например, от пяти до 50 миллисекунд.

Для каждого указанного раздела изображения делаются каждые семь минут. С помощью систем машинного зрения Delta можно посетить до девяти срезов. Показанная здесь функция точного посещения точки является примером покадровой последовательности клетки-предшественника спинного мозга, трансфицированной конструкцией, экспрессирующей GFP альфа тубулин, визуализация которой была начата на срезе спинного мозга двухдневного эмбриона HH 12 стадии.

На этой ранней стадии нейронные клетки-предшественники подвергаются преимущественно прогениторному делению, во время которого клетки делятся, образуя еще две циклические клетки-предшественники. На этом рисунке показаны выбранные кадры из только что показанной последовательности интервальной съемки. Через 2 часа 20 минут клетка делится в плоскости расщепления, которая перпендикулярна апикальной поверхности, образуя две дочерние клетки.

Эти две клетки делятся еще раз через 24 часа 23 минуты и 25 часов и 54 минуты. Следующая покадровая последовательность представляет собой трансфекцию клетки G-F-P-G-P-I, маркирующей клеточную мембрану. Эта клетка подвергается делению, во время которого базальный отросток разделяется на две части, обозначенные белыми стрелками, и в равной степени наследуется дочерними клетками.

Выбранные кадры из этой покадровой последовательности показывают, что деление клеток происходит в ноль часов и 49 минут. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как готовить и визуализировать срезы спинного мозга. Помните, что если вы новичок в этой технике, вы можете поначалу испытывать трудности, поскольку существует ряд технически сложных шагов, которые должны быть объединены, чтобы это сработало.