Живая съемка подвижность клеток и актинового цитоскелета отдельных нейронов и нервных клеток Крест в данио рерио Эмбрионы

Чтобы изобразить поведение отдельных клеток in vivo, в эмбрионы рыбок данио вводят ДНК плазмы, содержащую специфический для клетки промотор, стимулирующий экспрессию флоры, или биосенсор. Динамические изменения в распределении визуализируются in vivo с помощью биосенсора, основанного на F-эффекте и связывающем домене утрофина. Только что оплодотворенные эмбрионы выстраиваются вдоль предметного стекла и располагаются в углу, образованном между верхним и нижним предметными стеклами.

В клетку вводится ДНК, кодирующая фторочетверки или биосенсоры. На следующий день. Эмбрионы монтируются в арос.

На предметном стекле эмбрионы располагаются мечеными клетками вниз, а камера закрывается покровным стеклом. Здравствуйте, я Эрика Андерсон из лаборатории Мэри Халлин и факультетов зоологии и анатомии в Университете Висконсина в Мэдисоне. Меня зовут Нам Таури, я тоже из лаборатории Халлин.

А я Мэтт Клей из лаборатории Халлина. Сегодня мы покажем вам процедуру визуализации в реальном времени индивидуально меченых клеток в эмбрионах рыбок данио. Мы используем эту процедуру в лабораторных условиях для изучения подвижности клеток и динамики актина во время роста аксонов и миграции клеток нейрогребня.

Итак, приступим. Чтобы собрать инъекционные стекла, сначала приготовьте силиконовый эластомер cyl guard в соответствии с инструкциями производителя. Смешайте 10 частей эластомерной основы с одной частью отвердителя.

Используйте защитный кожух цилиндра для соединения трех стандартных стекол микроскопа вместе. Расположите два слайда рядом друг с другом по длинным краям. Нанесите ARD на третий слайд и поместите его поверх двух других слайдов.

Используйте ровно столько сигары, сколько нужно, чтобы запечатать слайды без чрезмерного сочиния между слайдами. Излишки можно удалить на следующий день с помощью бритвенного лезвия. Оставьте защитный кожух SIL на ночь для визуализации предметных стекол.

Мы используем прямоугольники из нержавеющей стали, вырезанные по размеру как у стандартного стеклянного микроскопа Slide с отверстием в 1,5 сантиметра, вырезанным в центре. К стальному прямоугольнику прикреплен защитный колпачок размером 22 мм с защитным кожухом. Как предметные стекла для инъекций, так и предметные стекла для визуализации являются многоразовыми и могут быть очищены между использованием 70% этанолом с последующим промыванием водой перед введением эмбрионов.

Разбавьте ДНК до конечной концентрации от 10 до 50 микрограммов на миллилитр. ДНК содержит 0,2% фенил-красных в воде. Фенильный красный обеспечивает визуализацию во время инъекции.

Далее заполните и откалибруйте иглу. Заполните аполийскую капиллярную иглу примерно микролитрами раствора ДНК. Подождите, пока игла заполнится, а затем вставьте ее в иглодержатель инъекционного аппарата с помощью тонких щипцов.

Отломайте кончик от иглы так, чтобы отверстие кончика было примерно 10 микрометров в диаметре. Измерьте диаметр капли в минеральном масле с помощью окулярного микрометра. Чтобы рассчитать объем впрыска, отрегулируйте настройку продолжительности пико-шпритцера.

Таким образом, диаметр капли составляет 0,12 микрометра или примерно один нанолитр по объему. Обычно продолжительность составляет от 10 до 30 миллисекунд. Соберите эмбрионы одной клеточной стадии в среду E с тремя эмбрионами и перенесите примерно от 30 до 60 эмбрионов на предметное стекло

Расположите эмбрионы вдоль края верхнего предметного стекла и удалите большую часть трех Е так, чтобы эмбрионы удерживались на предметном стекле за счет поверхностного натяжения с помощью изогнутого рассекающего штифта. Поворачивайте эмбрионы так, чтобы клетка находилась у стенки предметного стекла для инъекций. С помощью микроманипулятора проведите иглу через корион эмбриона через желток и в единственную клетку эмбриона.

Введите в клетку от 0,5 до одного нанолитра раствора ДНК. Перенесите введенные эмбрионы в чашки Петри в Е три и поместите их в инкубатор при температуре 28,5 градусов Цельсия. При необходимости развитие можно замедлить, инкубируя эмбрионы при более низкой температуре на следующий день после инъекции.

Подготовьте эмбрионы к визуализации примерно за час до того, как эмбрионы достигнут желаемого возраста для визуализации. Удалите COR из эмбрионов с помощью тонких щипцов. Обычно мы начинаем визуализацию эмбрионов примерно через 14-17 часов после оплодотворения.

Затем отбираем эмбрионы с мечеными клетками с помощью препарирующего микроскопа, оснащенного флуоресценцией, мы используем объектив Forex на прицеле Nikon a Z 100 из-за его сочетания большого рабочего расстояния и большого увеличения. Поместите эмбрион в микропробирку с примерно 50 микролитрами V-3. Добавьте трику и расплавьте 1% агро с низкой температурой плавления, чтобы получить концентрацию 0,02% трики с помощью широкой стеклянной пипетки BORG.

Немедленно перенесите эмбрион в агрокапле на покровное стекло предметного стекла, прежде чем арос затвердеет, расположите эмбрион так, чтобы область с мечеными клетками была обращена вниз к нижнему покровному стеблю. Далее соберите камеру для визуализации. Смажьте одну сторону пластикового кольца силиконовой вакуумной смазкой и прикрепите его к металлическому изображению.

Нанесите смазкой на другую сторону кольца. Заполните камеру с помощью Е-3, содержащей 10 миллимолярных куч, и 0,02%Трика герметизировала верхнюю часть камеры, закрепив 22-миллиметровый квадратный защитный листок на верхней смазанной маслом поверхности кольца. Теперь эмбрион готов к четырем D-визуализациям, как будет показано в следующем разделе.

Детали получения изображения будут зависеть от специфики вашей системы микроскопа. В этой статье мы демонстрируем процесс покадровой съемки для конфокального микроскопа Olympus FB 1000. См. предыдущий протокол JO для покадровой съемки с помощью конфокальной системы Zeiss LSM five 10.

Поместите камеру визуализации в держатель предметного стекла на предметном столике микроскопа и сфокусируйтесь на эмбрионе с помощью объектива с 10 или 20 увеличениями. При попадании проходящего света переключитесь на числовую апертуру объектива 60x 1,2 или выше и сфокусируйтесь на меченой ячейке с эпифлуоресценцией в программном обеспечении FV. Нажмите на повтор xy, чтобы начать лазерное сканирование.

Настройте параметры съемки и элементы управления съемкой для оптимизации изображения для съемки серии Z. Установите верхнюю и нижнюю границы Зака вместе с размером шага. Нажмите на значок глубины в окне управления съемкой изображения и начните съемку, щелкнув значок пакета XY, Z, чтобы получить серию интервальной съемки.

Установите временной интервал и количество временных точек под временным сканированием. В окне настроек съемки нажмите на значок времени в окне управления съемкой изображений и начните съемку, щелкнув по иконке пакета XYZT. Мы представляем здесь репрезентативные фильмы и изображения отдельных меченых клеток.

Когда отдельные нейроны помечены, их аксоны не закрыты другими мечеными клетками, и, таким образом, расширения OD на аксонах и конусах роста хорошо видны. В этом фильме показан сенсорный нейрон, помеченный мембранной меткой RFP. Он простирается на два аксона в противоположных направлениях, которые выходят из поля зрения.

Третий аксон проходит ортогонально от тела клетки и образует ответвления. Аналогичным образом, маркировка отдельных клеток нервного гребня позволяет визуализировать мелкие клеточные процессы, связанные с подвижностью клеток. Здесь две клетки нервного гребня помечены мембранным GFP.

Они проявляют обширную выпячивающую активность во время миграции в переднем направлении. Часто бывает полезно помечать отдельные клетки в пределах трансгенной линии, чтобы визуализировать взаимодействия между соседними клетками в популяции. На этом изображении показан эмбрион со стабильной экспрессией GFP во всех сенсорных нейронах, которому была введена метка RFP, кодирующая ДНК, чтобы пометить один нейрон красным цветом на фоне инъекции кодировки ДНК зелеными нейронами.

Актиновый биосенсорный зонд демонстрирует более сильное влияние сигнала в конусах роста и динамических выступах вдоль вновь образованных аксонов по сравнению с телом клетки. На более поздней стадии сигнал остается сильным в конусах роста, в то время как зрелые аксоны имеют значительно более слабый сигнал. Мы только что показали вам, как выполнять визуализацию в реальном времени индивидуально помеченных нейронов и клеток нервного гребня у эмбрионов рыбок данио.

При проведении этой процедуры важно выбирать эмбрионы, в которых ДНК не экспрессируется на уровнях, достаточно высоких, чтобы вызвать токсичность или гибель клеток. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.