Высокая пропускная способность синтеза углеводов и Функционализация Polyanhydride наночастиц

В этой видеостатье мы описываем новый протокол hydro put для автоматизированного фазового синтеза олигосахаридов в растворе и функционализации поли-анхи-наночастиц. С помощью этих агентов-мишеней на основе углеводов первые молекулы углеводов синтезируются с помощью автоматизированной системы, которая использует синтез растворной фазы вместо твердофазных синтезаторов. Затем олигосахаридные промежуточные продукты очищаются с помощью флориста, твердофазной экстракции или FSPE.

Полученные молекулы углеводов характеризуются ЯМР, а затем присоединяются к полиангидридным наночастицам путем конъюгации carbo IDE. Наконец, функционализированные углеводные наночастицы характеризуются рентгеновской фотоэлектронной спектроскопией и гидроанализом фенилсерной кислоты. В конечном счете, используя описанную здесь методологию гидропута, были получены условия реакции для оптимизации морфологии наночастиц и плотности углеводов на поверхности частиц.

Основное преимущество этого метода перед существующими, такими как синтез олигосахаридов с твердым лицом, заключается в том, что в этом методе мы используем значительно меньшее количество строительных блоков. Впервые у нас появилась идея этого метода, когда мы продемонстрировали эффективность поверхностных эффектов, функционализации полигидронаночастиц с использованием углеводов для нацеливания на рецепторы CEEP на клетках, препятствующих вдавливанию. Затем мы захотели разработать систему с высокой пропускной способностью, которая позволила бы нам проверять множество параметров, связанных с изготовлением и применением этих новых носителей.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку разработка автоматизированных платформ для высокопроизводительного синтеза олигосахаридов и их присоединения к полимерным частицам является новой областью исследований без большого количества доступной документации. Надлежащим образом защищенный донор сахара, обычно трихлорацетамид акцептор в основном в Alcon, фтористый спирт синтезируют на столе и готовят в хлорметане, также получают триметилсилос, трифторметанметансульфонат в хлорметане, 80% метанола и 100% метанола. Следите за тем, чтобы относительная влажность воздуха в помещении составляла 30% или ниже в камере автоматики.

Высокая влажность губительна для реакций гликозилирования. Следующие шаги выполняются с помощью платформы автоматизации. Первое гликозилирование проводится с помощью донора и флориста спиртом.

После этого полученная молекула сахара с цветочной биркой очищается с помощью FSPE. Затем временная защитная группа удаляется натрием, оксидом метамфетамина и метанолом, и снова продукт очищается с помощью FSPE. После этого сахарная бирка используется в качестве акцептора и соединяется с тем же донором для получения дисахарида, для начала работы дисахарид очищается FSPE.

Поместите в роботизированную платформу реагенты, в том числе промотор донорского акцептора, 80% метаноловую воду, 100% метанол, оксид метамфетамина натрия, и запустите программу. Роботизированная рука извлечет донора, а затем акцептор из флаконов и перенесет их в реакционный флакон. Затем смесь донора и акцептора перемешивают в течение 30 минут.

По прошествии 30 минут. Роботизированный манипулятор переносит в смесь каталитический триметилсилос, трифтор, сульфонат метана. Затем раствор перемешивают еще в течение 30 минут После завершения перемешивания программа приостанавливается.

Удалите аликвоту в 10 микролитров, чтобы проверить, завершена ли реакция с помощью тонкослойной хроматографии. Если реакция завершена, молекула-акцептор не будет видна. Если реакция не завершена, акцептор на ТСХ все еще виден.

Если это так, остановите программу, сбросьте время для гликозилирования примерно на 30 минут и добавьте избыток промотора триметилсилоса, трифтор, сульфоната метана. Когда реакция будет завершена, перейдите к следующему шагу. После завершения реакции робот переносит реакционную смесь в картриджи FSPE, содержащие модифицированный силикагель C 9 F 17 для очистки.

Далее картриджи промываются восемью миллилитрами 80% метанола, а затем восемью миллилитрами 100% метанола. Чтобы удалить фракцию non floris, проточный поток собирается во флакон для получения желаемого продукта, помеченного флористом. Если требуется дополнительная очистка, поставьте робота на паузу и удалите соответствующие продукты реакции.

В зависимости от структуры, доноры могут быть крайне нереактивными, и некоторое количество акцепторных молекул флориста останется даже после добавления достаточного количества промотора. Если это так, FSPE не будет достаточно эффективным для очистки, и дополнительная очистка с помощью силикагелевой колоночной хроматографии может быть выполнена после очистки, роботизированная рука дозирует оксид метамфетамина натрия в реакционный флакон. Затем реакцию перемешивают в течение двух часов на роботизированной платформе, и если она не завершена, как определено TLC, период инкубации продлевается примерно на час.

После завершения реакции продукт очищается с помощью ФСПЭ, как и раньше. Далее извлекают продукт реакции из робота и на столе подвергают растворению в безводном толуоле с последующим выпариванием для удаления остатков воды. После того, как образец высохнет, поместите его обратно в робот в том же цикле, включая очистку гликозилированием с помощью FSPE.

Глубокую защиту временной защитной группы с последующим гликозилированием повторяют до тех пор, пока не будет получена нужная длина цепи для молекулы-мишени, чтобы снять защиту защищаемого продукта, полученного в результате автоматизации, извлечь флакон из робота. На заключительных этапах процедуры используется взрывоопасный газообразный водород и они должны выполняться вне платформы автоматизации. На настольной унции происходит лизис двойной связи в флористической бирке с последующим окислением полученного альдегида до карбоновой кислоты.

Полученный продукт очистить с помощью силикагелевой колоночной хроматографии на стенде с использованием смеси 30% метанола в дихлорметане. Наконец, чтобы защитить бензоэфирные группы с помощью гидрогенизации, катализируемой палладием, пропустите продукт через спутниковую площадку, чтобы избавиться от палладия, чтобы получить чистый конечный продукт. Полная характеристика изделия с помощью ядерного магнитного резонанса или ЯМР-спектроскопии.

Высокопроекционный синтез полимеров и изготовление наночастиц осуществляется по протоколу, описанному Peterson et al. Как указано в сопроводительном документе, автоматизированное оборудование для осаждения, используемое для функционализации частиц, состоит из трех насосов по 1000 насосов, роботизированной ступени, интегрированной с двумя приводами, один из которых предназначен для движения в направлении X, а другой для движения в направлении Y, и второй роботизированной ступени с двумя соседними стойками, состоящими из трех приводов. К каждому направлению подключаются насосы и в общей сложности пять приводов. Последовательные приводы и насосы управляются компьютером с использованием программного обеспечения для лабораторного просмотра.

Сополимерные системы, используемые для изготовления частиц, основаны на кислоте SEBA или SA и одной из шести bis, паракарбокси, oxil heane или CPH и одной восьми BIS para carboxy phenoxy three six dioxane или CP Teeg. После места изготовления наночастиц для первой реакции выполняется штатив, содержащий центрифужные пробирки объемом 1,7 мл с библиотекой наночастиц до ступени линейного привода для присоединения углеводов к поверхности поли-частиц и реакции среднего сопряжения карбоновых кислот, состоящей из двух последовательных реакций. Наполните шприц в программируемом шприцевом насосе водным раствором EDC и этилендиамина в концентрации два миллиграмм на миллиграмм наночастиц и 0,6 мг на миллиграмм наночастиц соответственно.

Наполните второй шприц в программируемый шприцевой насос 2,5 миллиграмм на миллиграмм частиц NHSA всего 12 эквивалентов на образец наночастицы, водный раствор. Затем, используя программу лабораторного просмотра, дайте роботу команду для внесения суспензий реагентов в библиотеку наночастиц. Затем роботизированные приводы перемещают держатель трубки в правильное положение на платформе для выдачи растворов, EDC и NHS.

Активируйте группы карбоновых кислот на поверхности наночастиц полиангидрида и обеспечьте среднее взаимодействие. Затем погрузите ультразвуковой зонд в каждую трубку и обрабатывайте каждый образец ультразвуком в течение 30 секунд с частотой 40 герц. Перед переходом к следующему образцу очистите зонд ацетоном.

После того, как все образцы насыщены, держатель пробирки отсоединяется от роботизированной платформы. Инкубируйте суспензии наночастиц в течение девяти часов при постоянном вращении при четырех градусах Цельсия. Время реакции для первой и второй реакции может быть изменено для корректировки конечной концентрации сахаридов.

После завершения реакции центрифугируйте пробирки при 12 000 G в течение пяти минут. В холодных условиях вернитесь на роботизированную станцию. Снова прикрепите держатель трубки к роботизированной руке и заправьте второй шприц в роботизированную платформу.

При холодной воде первый шприц должен остаться пустым. Запустите робота. Надосадочная жидкость в каждой трубке забирается в пустой шприц, а второй насос подает в трубки холодную воду.

Этот этап выполняется для удаления любых нереактивных реагентов из суспензий наночастиц. Затем гомогенизируйте суспензию наночастиц с помощью ультразвука, как было показано ранее. Затем центрифугируйте пробирки при 12 000 умноженных на G в течение пяти минут.

Выполните вторую промывку холодной водой с использованием роботизированного аппарата для второй реакционной нагрузки: 12 эквивалентов на образец наночастиц EDC в первый насос и 12 эквивалентов на образец наночастиц NHS во второй насос. Запустите роботизированную платформу для дозирования достаточных объемов в пробирки, содержащие наночастицы. Наличие EDC и NHS позволит сформировать амидную связь между аминными группами из этилендита, уже прикрепленного к поверхности наночастицы, и группой карбоновых кислот глубоко защищенного сахара.

После завершения осаждения загрузите 10 эквивалентов определенного сахарида. В этом случае использовалась лактоза и контроль гликолевой кислоты в двух имеющихся насосах. Каждый сахарид наносится в пробирки в зависимости от желаемой функционализации для достижения в каждой пробирке, которая предварительно запрограммирована в программе лабораторного просмотра, используется для управления приводами и функциями насоса для конкретной реакции, используемой В этом исследовании для присоединения углеводов гликолевая кислота используется в качестве линкерного контроля, поскольку глубоко защищенные сахариды уже имеют ковалентно связанную эту молекулу. что позволяет в дальнейшем прикрепляться к поверхности наночастицы.

Суспензии наночастиц гомогенизируются с помощью ультразвука, как и раньше, а затем инкубируются в течение девяти часов при постоянном вращении при четырех градусах Цельсия. После инкубации промывают суспензии наночастиц центрифугированием, удаляя надосадочную жидкость, затем Resus суспендирует гранулу в холодной воде и помещают трубки, которые теперь содержат функционализированную библиотеку наночастиц, в вакуумную камеру для сушки в течение не менее двух часов. Функционализированные наночастицы характеризуются динамическим рассеянием света и другими методами оценки состава поверхности, концентрации, размера частиц, распределения по размерам и поверхностного заряда.

Показанная здесь полностью защищенная сторона диано была синтезирована с использованием платформы автоматизации. Синтезированное соединение было охарактеризовано протонным ЯМР в спектрометре VXR с частотой 400 мегагерц. Используя CDC 13 в качестве растворителя, образование продукта можно подтвердить по наличию некоторых характерных пиков.

На протонной ЯМР-диаграмме четыре протона от 1,79 до 2,21 и два протона от 3,38 взяты из флористской метки. Синглетный пик на уровне 2,16 соответствует пикам ацетатного пика на 4,94 и 5,11 являются аномерными протонами для оценки влияния времени реакции на конечную морфологию наночастиц и достигнутую степень присоединения сахара. Наночастицы функционализировались с увеличением времени реакции, как показано здесь, концентрация диано на поверхности 50-50 наночастиц CPT CPH увеличивалась с общим временем реакции и достигала максимума через 18 часов.

Наночастицы, функционализированные с общим временем реакции 24 часа, затем были использованы для оценки их способности нацеливаться на CLR на дендритные клетки, полученные из костного мозга мыши, с помощью проточной цитометрии, как показано здесь. Повышенная экспрессия знака DC и рецептора mano к лектиновым рецепторам типа C наблюдалась после стимуляции нефункционализированными, а также лактозными и даno функционализированными наночастицами. Это говорит об эффективном таргетинге.

Тем не менее, функционализированные частицы Диано показали более высокий уровень экспрессии, что указывает на специфичность этого лиганда для рецепторов, которые были изучены. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять высокопроизводительный автоматизированный синтез олигосахаридов, а также функционализацию полинаночастиц. Используя эти углеводные основания на нацеливание агентов, после освоения синтеза донора акцептора защищенного сахара, а также сборку аппарата можно произвести за 24 – 48 часов.

Конечно, продолжительность времени зависит от размера библиотеки, а также от времени функционализации. При использовании этого метода важно помнить, что вы можете оптимизировать условия реакции функционализации биоразлагаемых полигидрочастиц в зависимости от химического состава наночастиц. Следуя этой процедуре, можно синтезировать различные структуры углеводов для того, чтобы нацеливаться на различные клеточные рецепторы, влияющие на иммунологический результат.