Оценка репликации и функции бета-клеток в Adenovirally-трансдуцированных изолированных островков грызунов

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении сигнальных путей, которые регулируют изменения функциональной массы бета-клеток. Это достигается в изолированных глазках крыс путем чрезмерной экспрессии или подавления экспрессии гена с использованием аденовирусных векторов. После этой манипуляции функцию бета-клеток оценивают по секреции инсулина и репликации глазниц, измеренной путем включения тритиатированного тимидина.

В конечном счете, эти анализы могут показать, регулирует ли интересующий ген пролиферацию бета-клеток и/или функционирует in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии век, например, влияет ли определенный компонент сигнального пути на рост и функционирование бета-клеток? Приготовьте шестилуночный планшет, не покрытый тканевой культурой, добавив два миллилитра модифицированной среды в необходимое количество лунок.

Например, для типичного эксперимента может потребоваться три лунки, по одной для контроля вируса, для контроля вируса, и экспериментальная группа нагревает планшет до 37 градусов Цельсия в инкубаторе для культуры тканей в течение не менее 30 минут. Сразу после изоляции глазков крысы поместите от одного до 200 люверсов в каждую лунку подготовленной пластины. 60 глазков будут использоваться для биохимических анализов, а оставшиеся глазки могут быть использованы для исследований экспрессии генов или иммуноблоттинга

Ну а затем сразу же пипеткой нанесите аденовирус прямо на глазницы. В центре блюдо. Используйте от одного до 500 кратных вариантов инфекции в зависимости от эффективности аденовируса в чрезмерной экспрессии или подавлении интересующего вас белка.

Эффективное проникновение аденовируса в сердцевину века повышает постоянство результатов. Трансдукция век сразу за веком. Изоляция имеет важное значение.

Не тревожьте тарелку в течение пяти минут, после чего переместите ее в инкубатор на 24 часа. На следующий день достаньте тарелку из инкубатора и аккуратно набухните люверсы до центров лунок. Перенесите люверсы в новую лунку, содержащую свежую среду, с помощью микропипетки объемом 200 микролитров.

Если люверсы прилипнут к пластине, их можно аккуратно сместить с помощью наконечника пипетки. Полезно использовать контрольный вирус, экспрессирующий GFP, для проверки адекватной эффективности трансдукции с помощью конфокальной микроскопии для визуализации проникновения аденовируса в культуру ядра островков. На островках еще один-три дня, смена носителей ежедневно.

Время культивирования должно быть оптимизировано с помощью пилотных исследований и варьируется в зависимости от экспериментальных целей. В течение последних 24 часов добавляйте трититин в среду в концентрации один микрокюри на миллиметр среды. Сначала приготовьте свежеприготовленные 50 миллилитров рабочего САБ в 50 миллилитровую коническую трубку и прогрейте ее на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

Пипеткой внесите 10 миллилитров рабочего SAB в коническую трубку объемом 15 миллилитров и добавьте 66,8 микролитров 2,5 моляра глюкозы D. Чтобы приготовить SAB с высоким содержанием глюкозы, добавьте 44,8 микролитра 2,5 моноло D глюкозы к оставшимся 40 миллилитрам рабочего SAB. Для приготовления SAB с низким содержанием глюкозы далее наклейте три микроцентрифуги объемом 1,7 миллилитров

Для каждой лунки из шести лунок добавьте по одному миллилитру PBS в каждую трубку. Не забывайте следовать институциональным протоколам по обращению с радиоактивными люверсами и их утилизации. С помощью стереоскопа или стандартного микроскопа выберите и перенесите 20 люверсов сопоставимого размера в каждую микроцентрифужную пробирку.

Например, каждая трубка может содержать пять маленьких, 10 средних и пять больших проушин. Несмотря на то, что в конце эксперимента результаты нормализуются по общему содержанию белка, крайне важно, чтобы размер глазков соответствовал группам. После того, как люверсы осели на дне пробирки под действием силы тяжести или центрифугирования, отсадите, взвесьте PBS с помощью микропипетки, а затем приступайте к подготовке проушин для биохимического анализа.

Чтобы подготовить глазницы для анализа секреции инсулина, их необходимо предварительно инкубировать с низким содержанием глюкозы SAB. Для этого добавьте 400 микролитров SAB с низким содержанием глюкозы в пробирки и поместите их с крышками в инкубатор для культуры тканей В течение 60 минут через час отсасывайте преинкубационный SAB с низким содержанием глюкозы, чтобы измерить базальную секрецию инсулина. Повторите процедуру предварительной инкубации.

Тем не менее, для измерения стимулированной секреции инсулина используйте 400 микролитров SAB с высоким содержанием глюкозы вместо SAB с низким содержанием глюкозы и, как и раньше, инкубируйте глазки в течение 60 минут после инкубации в аспирате SAB с высоким или низким содержанием глюкозы и SAB для радиоиммуноферментного анализа инсулина, который будет выполнен в соответствии с протоколом производителя. Затем приступайте к анализу на включение тимидина с использованием той же коллекции люверсов. Начните с люверсов, которые используются только для анализа секреции инсулина.

Добавьте один миллилитр PBS и дайте люверсам осесть под действием силы тяжести. Затем аспирируйте PBS с помощью микропипетки. Отбросьте и повторите этот шаг еще раз.

Далее добавьте в люверсы 500 микролитров ледяной трихлоруксусной кислоты и выдержите их на льду в течение 30 минут. Центрифугируйте пробирки при температуре четыре градуса Цельсия. Затем аспирация, откажитесь от ТСА.

Далее добавьте 80 микролитров 0,3 нормального гидроксида натрия и инкубируйте люверсы в течение 30 минут комнатной температуры. Во время такой инкубации энергично перегоняйте образцы в течение 5-10 секунд каждые 10 минут. Параллельно добавьте четыре миллилитра конно-безопасного счетного коктейля в семь миллилитров жидких сцинтилляционных счетных пробирок.

Когда инкубация люверсов закончится, добавьте 50 микролитров люверсов в сцинтилляционную трубку. Кратковременно встряхните закрытую пробирку и измерьте радиоактивность образцов в жидкостном сцинтилляционном счетчике. Также для измерения концентрации белка переведите 10 микролитров виласа в коммерческий анализ бионической кислоты и следуйте протоколу производителя.

В дальнейшем, во время анализа данных, нормализовать результаты до концентрации белка с помощью описанных протоколов. Репликация глазков и функция бета-клеток. У крыс оценивали аденовирусную сверхэкспрессию гипотетического гена из шести надежно стимулированных репликации глазков без изменения функции бета-клеток.

Повышенная экспрессия гена 6, увеличение синтеза ДНК, измеряемое включением тимидина, поскольку большинство клеток в глазнице крысы являются бета-клетками. Дальнейшие эксперименты могут показать, что это увеличение включения тимидина связано с увеличением репликации бета-клеток. Анализ секреции инсулина показал, что сверхэкспрессия гена 6 не изменяет одну из основных функций бета-клеток: секрецию инсулина при низком и высоком уровне глюкозы.

Увеличение секреции инсулина при низких и высоких концентрациях глюкозы отражает состояние глазниц после лечения аденовирусом. Если увеличение экспрессии гена 6 нарушает функцию бета-клеток, это, вероятно, отразится на снижении инсулина, секретируемого при высоких концентрациях стимуляции и глюкозы. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как измерять репликацию бета-клеток и секрецию инсулина, чтобы определить, влияет ли конкретный ген на рост или функцию бета-клеток.