Векторной ДНК на основе РНК-интерференции по изучению функции генов в Раке

Общая цель данной процедуры заключается в определении функции гена с помощью РНК-интерференции на основе ДНК-векторов. Это достигается путем первоначального проектирования и создания конструкций shRNA, нацеленных на специфические гены. Вторым этапом является получение лентивируса, несущего экспрессионную кассету shRNA.

Затем создаются стабильные клеточные линии путем инфицирования клеток лентивирусом, и эти инфицированные лентивирусом клетки используются в различных анализах in vitro и in vivo для определения эффектов сайленсинга целевого гена. В конечном итоге, в зависимости от используемых методов анализа, результаты могут показать изменения туморогенности клеток вследствие нокдауна гена, что определяется с помощью тестов на пролиферацию, миграцию и инвазию in vitro, а также моделей формирования ксенографтов in vivo. Демонстрировать процедуру будут Дэниэль Стоуэлл и Ма Хуан; Дэниэль является аспирантом в моей лаборатории, а Ма — техником.

Чанг — postdoctoral fellow. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований рака, например, играет ли определенный ген роль в развитии и прогрессировании рака и для каких аспектов этих процессов он может быть важен. Для начала спроектируйте и закажите олигонуклеотиды на основе описанных критериев: два реверсивно-комплементарных олиго, которые содержат целевую последовательность из 20–23 нуклеотидов в целевом гене.

Они сформируют сайты EcoR1 и HindIII на двух концах. После отжига другой олигонуклеотид, содержащий обратную комплементарную последовательность к целевой последовательности, отжигается своим 3'-концом к 3'-концу промотора H1 или U6 с помощью прямого праймера.

С помощью ПЦР синтезируйте фрагмент, имеющий сайты BamH1 и HindIII на обоих концах. Параллельно проведите рестрикцию лентивирусного вектора и ПЦР-фрагмента. Затем проведите реакцию лигирования трех фрагментов: вектора, ПЦР-фрагмента и аннулирующих олигонуклеотидов.

При молярном соотношении 1:10:10 полученный вектор обеспечит экспрессию интересующей hpRNA с последовательностью HindIII в области петли. При использовании индуцибельного вектора продукция hpRNA будет зависеть от наличия молекулы-индуктора, такой как доксициклин для системы Tet-on. Теперь проведите трансформацию высокоэффективных компетентных клеток e coli DH5α, используя продукт лигирования, и идентифицируйте положительные векторы с помощью ПЦР-скрининга колоний.

Проведите амплификацию продукта, перекрывающего вектор и сайт лигирования индуцибельного промотора. Выделите плазмидную ДНК из положительных колоний с помощью коммерческого набора. Затем подтвердите наличие вставки путем рестрикции ферментами BAM H one и ECO R one и с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле.

Кроме того, проведите секвенирование области, содержащей промотор и S-H-R-N-A, с использованием праймера LIGA nucleotide P five. С помощью набора для MIDI- или maxi-препарирования, свободного от эндотоксинов, подготовьте ДНК лентивируса, несущую экспрессионную кассету HRNA. Определите концентрацию ДНК путем измерения поглощения света на длине волны 260 nm и убедитесь в чистоте ДНК, проверив, чтобы отношение поглощения света на 260 и 280 nm находилось в пределах от 1,8 до 2,0.

В завершение проведите электрофорез плазмиды лентивируса в аэрогеле, чтобы убедиться, что она находится в суперскрученном состоянии. Перед трансфекцией подготовьте реакционную смесь: медленно добавьте 0,9 миллилитра раствора A к 0,9 миллилитра раствора B, при этом постоянно продувая раствор B воздухом с помощью пипетки. Затем инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее медленно нанесите по 0,6 миллилитра смеси на три разные 10-сантиметровые планшеты с клетками HEK 293 T.

Затем верните клетки в инкубатор через четыре-шесть часов. Замените среду на семь миллилитров полной среды DMEM. Через 24 часа добавьте еще пять миллилитров среды, а еще через 24 часа соберите среду, содержащую лентивирус.

Центрифугируйте собранную среду при 1500 RPM при комнатной температуре в течение 10 минут. Отфильтруйте супернатант через фильтр с размером пор 0.45 мкм. Концентрируйте полученный фильтрат, содержащий лентивирус, путем ультрацентрифугирования.

Слейте супернатант в контейнер для отходов, содержащий 5% bleach. Ресуспендируйте осадок лентивируса в 0,5–1 мл холодного 1x PBS. Затем разделите раствор лентивируса на аликвоты по 50–100 µL для хранения при -80 °C.

Наконец, определите титр лентивируса с помощью надежного метода. Как правило, в чашке для культивирования диаметром 10 см вырабатывается от 50 до 100 миллионов инфекционных единиц перед тем, как приступить к заражению клеток. Для данной процедуры определите MOI титра лентивируса, используя набор реагентов или метод R-T-P-C-R.

Рекомендуется использовать MOI ниже четырех. Начните с высева клеток, предназначенных для инфицирования, в шестилуночный планшет до достижения конфлюэнтности 30–40% и культивируйте их в течение ночи. На следующий день.

Замените среду на 1 мл свежей среды, содержащей полибрейн или протамин. Затем добавьте от 1 до 2 миллионов IU лентивируса, содержащего флуоресцентный маркер или маркер антибиотика.

Медленно встряхивайте планшет в течение 10 секунд для перемешивания и инкубируйте его в течение шести часов. По истечении шести часов замените среду на обычную полную среду и культивируйте клетки в течение двух дней. Среды не должны содержать антибиотиков или индукторов независимо от используемого лентивируса по прошествии двух дней.

Добавьте соответствующий антибиотик, если лентивирус содержит антибиотический маркер. Аналогично, добавьте индуктор в половину культур, если лентивирус является индуцибельным. После культивирования клеток в течение еще двух или трех дней с антибиотиками и индукторами проведите вестерн-блот-анализ, чтобы проверить нокдаун целевого гена перед трипсинизацией клеток для ксенографта.

Соберите клетки из больших чашек для культивирования и ресуспендируйте их в исходной среде, содержащей 50% Matrigel. Крайне важно поддерживать суспензию раковых клеток в 50% Matrigel и шприц на льду. В противном случае существует риск затвердевания Matrigel, что приведет к порче препарата.

Подготовьте операционное поле, тщательно очистив его 70% ethanol; проведите анестезию при обеспечении отличной вентиляции и с фильтром-поглотителем isof fluorine, установленным на индукционную камеру. Анестезируйте мышей линии thymic nude, используя 2% isof fluorine в смеси с 1.5% oxygen за три-пять минут до инокуляции клеток. Затем поддерживайте анестезию, используя 2% isof fluorine в смеси с oxygen через носовую маску.

Поместите мышь на нагревательную подложку, установленную на 30 °C. Загрузите клетки в шприцы с иглами калибра 25,5 для подкожных инъекций или калибра 28–30 для ортотопических инъекций. Через пять минут после введения анестезии введите от 1 до 10 миллионов клеток болюсами по 200 µL в одну или две точки введения.

Количество клеток зависит от степени злокачественности или агрессивности раковых клеток. Для конститутивно активных векторов используйте две группы мышей, которым вводят клетки, экспрессирующие либо целевой ген S-H-R-N-A, либо контрольный скремблированный S-H-R-N-A на векторах. Используйте те же две группы, разделив каждую из них на подгруппы, которым в воду добавляют индуктор или нет.

Дважды в неделю заменяйте воду в поилках. Контролируйте объем опухолей еженедельно или раз в две недели с помощью штангенциркуля. Следите за тем, чтобы объем опухоли не превышал лимит, установленный учреждением или комитетом по уходу и использованию животных (IACUC); эвтаназируйте всех животных с обширной изъязвленностью, выраженным некрозом, явными признаками инфекции, неконтролируемым кровотечением или терминальной стадией заболевания. Для мониторинга роста и метастазирования опухоли с помощью биолюминесцентного маркера продезинфицируйте рабочую зону и анестезируйте мышей в камере для визуализации с использованием газообразного наркоза.

Сначала выполните экспозицию продолжительностью от двух до пяти минут, проверьте интенсивность сигнала, а затем соответствующим образом скорректируйте параметры. Если размер опухоли превышает 1000 кубических миллиметров или установленный в учреждении предел размера, проведите эвтаназию животного при забое, зафиксируйте размер опухоли и сохраните образцы для дальнейшего анализа. Данный протокол использовался для изучения влияния нокдауна why Y one на формирование ксенографтов опухолей из экспрессирующих люциферазу клеток аденокарциномы молочной железы человека, имплантированных атимическим обнаженным мышам.

Были протестированы целевая последовательность S-H-R-N-A для человеческого YY1 и скрамблированный контрольный S-H-R-N-A, не имевший значительного сходства с каким-либо известным человеческим транскриптом. В результате были сконструированы два лентивирусных вектора, которые использовались для получения двух лентивирусов. Оба вируса применялись для инфицирования двух различных популяций клеток, в результате чего были получены поликлональные клеточные популяции.

После селекции пуромицином вестерн-блот-анализ подтвердил нокдаун YY1, индуцированный DS, в этих инфицированных клеточных линиях. Далее была использована поликлональная популяция клеток клона три, инфицированных индуцибельной shRNA против YY1 и контрольной shRNA.

Для проверки влияния истощения YY1 на инвазию использовали ЛЕНТИВИРУСЫ. Мы обнаружили, что истощение YY1 снижало инвазивность клеток. Вестерн-блот-анализ подтвердил индуцированный сайленсинг YY1 в клетках с индуцибельной shRNA к YY1, в то время как клетки, содержащие контрольный вектор, не проявляли таких изменений.

S-H-R-N-A не проявила данного эффекта. Эти клетки затем были использованы в исследовании на мышиной модели ксенографта в сравнении с контрольными группами indu и YY one; у мышей с имплантированными клетками S-H-R-N-A, получавших воду, наблюдалось ожидаемое значительное снижение образования опухолей при визуализации методом биолюминесценции и при измерении массы опухолей. Сайленсинг YY one в этих ксенографтных опухолях был легко подтвержден методом вестерн-блоттинга.

Исследования: не забывайте, что работа с лентивирусом может быть крайне опасной; согласно рекомендациям NIHB по безопасности при исследованиях с лентивирусными векторами, во всех лабораторных условиях требуется соблюдение процедур сдерживания второго уровня биологической безопасности.