Векторной ДНК на основе РНК-интерференции по изучению функции генов в Раке

Общая цель этой процедуры заключается в определении функции гена с помощью РНК-интерференции на основе вектора ДНК. Это достигается путем разработки и создания конструкций S-H-R-N-A, нацеленных на конкретные гены. Вторым шагом является получение лентивируса, несущего кассету экспрессии SH РНК.

Затем стабильные клеточные линии генерируются путем инфицирования клеток лентивирусом, и клетки, инфицированные лентивирусом, используются в различных анализах in vitro и in vivo для определения эффектов сайленсинга интересующего гена. В конечном счете, в зависимости от используемых анализов, результаты могут показать изменения в опухолевой генности клеток в результате нокдауна гена с помощью анализов пролиферации, миграции и инвазии in vitro, а также моделей формирования ксенотрансплантатов in vivo. Демонстрировать процедуру будет Дэниел Стоуэлл, Ма Хуан, а Дэниел - аспирант в моей лаборатории.

Чанг является научным сотрудником с докторской степенью. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований рака, например, играет ли конкретный ген роль в развитии и прогрессировании рака, и для каких аспектов этих процессов он может быть важен. Для начала проектирования и упорядочивания олигонуклеотидов на основе описанных критериев анил два обратных комплементарных олигонуклеарта, которые содержат от 20 до 23 нуклеотидных последовательностей-мишеней в гене-мишени.

Они сформируют эко R один и хинди три участка на двух концах. После того, как он встал на колени, другой олиго содержит обратную комплементарную последовательность к целевой последовательности и ее три основных конца. Нил на три основных конца промотора H one или U six с грунтовкой на входе.

С помощью ПЦР сделайте фрагмент, который имеет один сайт BAM H и три сайта на хинди на каждом конце. Тем временем расщепляют лентивирусный вектор и фрагмент ПЦР. Затем проводят реакцию лигирования трех фрагментов между вектором, фрагментом ПЦР и анильными олигонуклеотидами.

При молярном соотношении один к 10 к 10 результирующий вектор будет производить интересующую HRNA с последовательностью хинди три в области петли. Если используется индуцируемый вектор, производство HRNA будет зависеть от наличия молекулы-индуктора, такой как доксициклин, для системы Tet on. Теперь трансформируйте высокоэффективные, компетентные пять альфа-клеток ecoli DH с помощью лигированного продукта и определите положительные векторы с помощью ПЦР-скрининга на основе колоний.

Амплифицируйте продукт, охватывающий вектор и сайт лигирования индуцируемого промотора. Подготовьте плазменную ДНК из положительных колоний с помощью коммерческого набора. Затем подтвердите наличие вставки с помощью расщепления BAM H one и ECO R one и с помощью ДНК агарозного электрофореза.

Кроме того, секвенируют область, содержащую промотор и S-H-R-N-A, используя нуклеотид LIGA P five. Используя набор для подготовки MIDI или maxi без эндотоксинов, подготовьте ДНК лентивируса, несущую кассету экспрессии HRNA. Определите концентрацию ДНК, измерив поглощение света на глубине 260 нанометров, и убедитесь в чистоте DNA, проверив, что коэффициент поглощения света от 260 до 280 нанометров находится в диапазоне от 1,8 до 2,0.

Наконец, запустите лентивирусную плазмиду на аэрогель, чтобы убедиться, что она свернута S. Перед трансфекцией подготовьтесь к трансфекции, сначала медленно капая 0,9 миллилитра раствора А в 0,9 миллилитра раствора В, одновременно пропуская воздух через раствор В с помощью пипетки. Затем выдерживают смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем медленно капните 0,6 миллилитра смеси на три разные 10-сантиметровые пластины с HEK 2 93 Т-клетками.

Затем верните клетки в инкубатор через четыре-шесть часов. Замените среду семью миллилитрами полной среды DMEM. Через 24 часа добавьте еще пять миллилитров среды, а еще через 24 часа соберите среду, содержащую лентивирус.

Отжимайте собранную среду при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 10 минут. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,45 микрометра. Прокрутите поток через среду, содержащую лентивирус, путем ультрацентрифугирования.

Сцедите надосадочную жидкость в контейнер для отходов, содержащий 5% отбеливателя. Ресуспендируйте гранулу лентивируса в одной половине до одного миллилитра холодной одной XPBS. Затем разделите раствор лентивируса на 50-100 микролитров аликвот для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Наконец, определите титр лентивируса с помощью надежной методики. Как правило, 10-сантиметровая чашка для культивирования производит от 50 до 100 миллионов инфекционных единиц, прежде чем приступить к клеточной инфекции. Определите MOI лентивирусного титра с помощью набора или R-T-P-C-R для этой процедуры.

Рекомендуется MOI ниже четырех. Начните с посева инфицированных клеток в шестилуночный планшет до 30-40% плавности и культивируйте их в течение ночи. На следующий день.

Замените среду одним миллилитром свежей среды, содержащей полимозг или протамин. Затем прибавьте от одного до 2 миллионов ме. Лентивирус, содержащий флуоресцентный или антибиотический маркер.

Медленно встряхивайте тарелку в течение 10 секунд, чтобы перемешать и инкубировать ее в течение шести часов. Через шесть часов замените среду на нормальную, полноценную среду и размножайте клетки в течение двух дней. Среда не должна содержать антибиотики или индукторы, независимо от используемого лентивируса через два дня.

Добавьте соответствующий антибиотик, если лентивирус содержит маркер антибиотика. Аналогичным образом, добавьте индуктор в половину культур, если лентивирус индуцируем. После культивирования клеток в течение еще двух или трех дней с помощью антибиотиков и индукторов проведите западный анализ крови, чтобы проверить нокдаун целевого гена перед ксенотрансплантатом трипсиновых глаз.

Клетки из больших клеточных культур вытравливают и ресуспендируют их в исходной среде, содержащей 50% матригеля. Важно держать раковые клетки в ресуспензии и в 50% матригеля и шприца на льду. В противном случае есть риск, что матригела затвердеет и инфекция должна будет сообщить об этом AB.

Подготовьте место операции, тщательно очистив его 70% этанолом, и проведите анестезию с отличной вентиляцией и фильтром-поглотителем фтора, прикрепленным к индукционной камере. Обезболите голых мышей с использованием 2% изофтора, смешанного с 1,5% кислорода, за три-пять минут до инокуляции клеток. Затем поддерживайте анестезию с помощью 2%-ного изоизофтора, смешанного с кислородом, через носовой конус.

Расположите мышь на грелке, установленной на 30 градусов Цельсия. Загрузите клетки в шприцы с помощью игл 25 с половиной калибра для подкожных инъекций или игл от 28 до 30 калибра для ортотопических инъекций. Через пять минут после индукции анестезии в одном или двух местах введите от одной до 10 миллионов клеток в 200 микролитровых болюсах.

Количество клеток зависит от злокачественности или агрессивности раковых клеток. Для конститутивно активных векторов используют две группы мышей, которым вводят клетки, экспрессирующие либо ген-мишень S-H-R-N-A, либо скремблированный S-H-R-N-A fortet на векторах. Используйте те же две группы и разделите их каждую на подгруппы, которые являются или не содержат индуктор в своей воде.

Заменяйте таблетки, содержащие воду, два раза в неделю. Контролируйте объем опухолей еженедельно или раз в две недели с помощью С. Убедитесь, что объем опухоли не превышает предел учреждения или A CUC, и усыпьте любых животных, у которых наблюдается обширное изъязвление, явная инфекция некроза, неконтролируемое кровотечение или терминальная стадия заболевания. Чтобы контролировать рост опухоли и метастазирование с помощью биолюминесцентного маркера, продезинфицируйте рабочую зону и обезболите мышей в камере визуализации с газовой анестезией.

Сначала сделайте двух-пятиминутную выдержку и проверьте интенсивность сигнала, а затем отрегулируйте соответствующим образом. Если размер опухоли превышает 1000 кубических миллиметров или установленный предельный размер, усыпьте животное после жертвоприношения, задокументируйте размер опухоли и сохраните ее для дальнейшего анализа. Этот протокол был использован для изучения влияния нокдауна Y one на образование ксенотрансплантата опухоли люциферазы, экспрессирующей клетки аденокарциномы молочной железы человека, имплантированные атимическим обнаженным мышам.

Были протестированы последовательность-мишень S-H-R-N-A человеческого YY и скремблированного контрольного S-H-R-N-A, которые не имели существенного сходства ни с одной из известных человеческих транскриптов. В результате были сконструированы два лентивирусных вектора, которые были использованы для получения двух лентивирусов. Оба были использованы для инфицирования двух разных клеточных популяций, и были получены популяции поликлональных клеток.

После отбора мицина. Западный анализ крови подтвердил, что DS индуцировал YY один нокдаун в этих инфицированных клеточных линиях. Затем популяция поликлональных клеток третьего клона, который был инфицирован индуцируемым YY одним S-H-R-N-A и контролем. С-Х-Р-Н-А.

Лентивирусы были использованы для проверки влияния истощения YY one на инвазию. Мы заметили, что истощение YY за один раз снижает инвазивность клеток. Западный анализ крови подтвердил, что врачи индуцировали сайленсинг YY one в клетках с индуцом YY one S-H-R-N-A, в то время как клетки, содержащие контроль.

S-H-R-N-A не показал этого эффекта. Затем эти клетки были использованы в исследовании мышиной модели ксенотрансплантата по сравнению с контрольными группами indu, YY у одной имплантированной мыши S-H-R-N-A, получавшей дозы, содержащие воду, наблюдалось значительное снижение образования опухоли при визуализации с помощью биолюминесценции и при измерении массы опухоли в соответствии с ожиданиями. YY один сайленсинг в этих опухолях ксенотрансплантата был легко подтвержден вестерн-блоттингом.

Исследования Не забывайте, что работа с лентивирусом может быть чрезвычайно опасной в соответствии с соображениями безопасности NIHB: для исследований с лентивирусными векторами требуется повышенный уровень безопасности B для всех лабораторных условий.