Количественные оценки миграции клеток в Phagokinetic анализа подвижности трек

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы иметь возможность количественно измерить клеточную подвижность с течением времени с помощью анализа подвижности клеток на основе наночастиц золота. Это достигается путем предварительной подготовки стеклянных покровных стекол для покрытия наночастицами золота. В частности, покровные листы, не содержащие эндотоксинов, покрываются желатином, а затем запекаются.

Второй шаг – это уменьшение хлорориевой кислоты, которая приведет к образованию наночастиц золота и равномерное покрытие желатиновой крышки плитки раствором. Затем ячейки помещаются на защитные стекла с покрытием из наночастиц золота на желаемый период времени работы экспериментальных ячеек. Двигаясь дальше, желатин будет вытеснять наночастицы золота, создавая дорожки.

Заключительным этапом является мониторинг и количественная оценка подвижности клеток с помощью микроскопии для визуализации треков, созданных движущимися клетками. В конечном счете, измерения площади треков выполняются с помощью бесплатного программного обеспечения. Одним из основных преимуществ этого метода перед существующими методами, такими как покадровая съемка, является то, что для этого анализа требуется только стандартный световой микроскоп, стандартная камера, и используется свободно доступное программное обеспечение для визуализации.

Кроме того, анализ также позволяет легко анализировать и сравнивать несколько образцов с помощью методиста, способного проводить высокопроизводительный скрининг. Хотя этот метод может дать представление о влиянии различных физиологических факторов и движения клеток, он также может быть применен к другим системам, таким как исследования влияния патогенов на подвижность инфицированных клеток. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что метод требует строгого соблюдения объемов и температур, указанных в протоколе.

В этом протоколе акцент сделан на оценке цвета конечного раствора осажденных наночастиц золота для обеспечения успеха. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Поскольку FGO анализирует моторику кинетического следа, этапы анализа трудно изучить.

Они содержат несколько процедур, которые обычно не используются в лабораториях клеточной и молекулярной биологии. Для приготовления покрытых желатином покровных стекол сначала суспензируют желатин и деионизированную воду до получения раствора с конечной концентрацией 0,5 грамма на 300 миллилитров, а затем автоклавируют смесь в течение 15-30 минут. Важно сделать это в течение двух часов после добавления желатина в вытяжку для культуры тканей.

Подготовьте покровные стекла к нанесению покрытия, сначала переложив восемь-девять кислотно вымытых покровных стеблей в 100-миллиметровую пластиковую посуду. Следите за тем, чтобы покровные листы не касались друг друга или стенок блюда. Осторожно нанесите две-три капли желатина на каждую защитную пластинку, не допуская перелива на пластину.

Затем поместите форму с покрытой желатином крышкой в духовку и выпекайте при температуре 90 градусов Цельсия в течение 10 минут. Через 10 минут достаньте блюдо из духовки и верните его к салфетке. Культурный капюшон.

Аккуратно удалите излишки желатина. Верните блюдо в духовку и просушите крышку при температуре 70 градусов Цельсия в течение 45 минут. Как только крышка высохнет, достаньте блюдо из духовки и верните его в тканевую культуральную вытяжку.

С помощью стерильной иглы аккуратно приподнимите вверх одну сторону покровного листика. Затем с помощью стерильного пинцета снимите покрытые желатином покровные листы с посуды и поместите их в отдельные лунки по 24 лунки пластины. Следующим этапом является подготовка покровных накладных с коллоидным золотым напылением.

Начните с приготовления 10 миллилитров 0,5%-ного раствора цитрата натрия, работающего в тканевом культурном колпаке, в сочетании с 1,5 миллилитрами 14,5 миллилитров раствора хлоро-орифовой кислоты и 13,5 миллилитров деионизированной воды в автоклавной колбе Эрленмейера, свободной от эндотоксинов. Хлорокориевая кислота токсична, и с ней следует обращаться осторожно. Он также чувствителен к свету, поэтому этап кипячения следует проводить при слабом освещении.

Когда раствор достигнет точки кипения, снимите колбу с горячей плиты и переложите ее на пластину для перемешивания. Чтобы образовать частицы коллоидного золота в растворе, добавьте 0,7 миллилитра 0,5% раствора цитрата натрия на 15 миллилитров раствора хлороОРИЕВОЙ кислоты при перемешивании, продолжайте перемешивать примерно две минуты. За это время раствор изменится от слабого желтого до прозрачного, серого, от фиолетового до темно-фиолетового.

Прежде чем окончательно достичь цвета красного вина или ржавчины, наберите раствор коллоидного золота в пипетке объемом 10 миллилитров и дайте раствору остыть в пипетке в течение одной-двух минут, пока он не достигнет комнатной температуры. Затем добавьте от 0,5 до одного миллилитра поверх покрытых желатином защитных колпачков в 24-луночную пластину. Поместите 24-луночную пластину, содержащую покрытые коллоидным золотом покровные листы, в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение 30 минут. После того как частицы успеют осесть на покрытые желатином покровные листы, проверьте их плотность под световым микроскопом.

Правильное распределение наночастиц золота помогает легко и эффективно различать края солнечных грузовиков. Оптимальная плотность зависит от размера клетки. Слишком высокая концентрация частиц золота препятствует способности клеток двигаться, в то время как слишком низкая концентрация золотых частиц ограничивает способность очертить точную траекторию подвижности.

По этой причине в отдельных экспериментах следует использовать только чехлы, изготовленные в одной партии или имеющие одинаковую плотность. Если концентрация частиц золота недостаточна, добавьте дополнительно от 0,5 до одного миллилитра раствора коллоидного золота в покрытые желатином покровные листы. Однако, если концентрация частиц золота слишком высока, как в показанном здесь случае, единственным эффективным выбором является переделка раствора коллоидного золота и покрытие новых покровных стекол.

Если плотность частиц правильная, верните планшет в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение одного часа, чтобы на ночь смыть несвязанные частицы золота, трижды опустив крышку в стерильный фосфатно-солевой буфер. Затем храните покровные стекла с коллоидным золотым покрытием в заполненных PBS лунках чистой 12-луночной пластины при температуре четыре градуса Цельсия, пока они не будут готовы к использованию. Чехлы не должны высыхать и должны использоваться в течение двух-трех месяцев с даты их изготовления.

Следующим этапом является подготовка покровных листков с коллоидным золотым покрытием для культивирования клеток. Начните с помещения их в отдельные лунки 24-луночного планшета, в которые было добавлено приблизительно 0,3 миллилитра питательной среды до добавления покровного покрытия. Количество ячеек зависит от типа ячейки, но плотность ячеек должна быть достаточно низкой, чтобы предотвратить перекрытие дорожек ячеек из нескольких ячеек в одной области.

Накройте планшет крышкой и поместите его в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом на срок от шести до 24 часов Исходя из подвижности типа клеток, следует экспериментально определить оптимальные временные рамки для каждого типа клеток после инкубации, устранить любые покровные листы, которые не будут проанализированы сразу, сначала дважды погрузив их в PBS с последующей инкубацией в 3% параформальдегиде в течение 15 минут при комнатной температуре с использованием Световые снимки треков, созданных одной движущейся ячейкой на незакрепленных или неподвижных покровных листах. Увеличение, используемое для получения изображений треков сотовых клеток, варьируется в зависимости от типа ячейки. Тем не менее, для каждого исследования необходимо использовать одно и то же увеличение, чтобы иметь возможность сравнивать результаты.

Для моноцитов 40-кратное увеличение хорошо работает с использованием свободно доступного программного обеспечения, такого как image, JNIH image или image tool для определения средней площади коллоидного золота, очищенной от 10 до 20 или более клеток для каждого образца из показанных здесь изображений, является очищенным путем частиц коллоидного золота одним нестимулированным моноцитом, взятым с объективом 40-кратного увеличения. Неподвижные клетки создают вокруг себя характерные небольшие овальные или круглые следы, что говорит о низком вассальном уровне движения. Напротив, высокоподвижные клетки характеризуются направленным движением в виде удлиненных участков и больших площадей из-за их неправильной формы.

Треки ячеек лучше всего анализировать с помощью инструмента от руки в программном обеспечении Image J, чтобы обозначить их объем. Затем можно выполнить количественные измерения площади с помощью инструмента измерения в меню анализа на изображении J. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о строгом соблюдении объемов и температур, указанных в протоколе, так как отклонения могут сильно повлиять на окончательные результаты. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создавать покровные листы, покрытые желатином, как готовить золотые наночастицы и покровные листы, покрытые золотыми наночастицами, а также как контролировать и количественно оценивать движение клеток с помощью световой микроскопии.

Не забывайте, что работа с кипящими растворами на горячей плите, особенно парами от кипящего раствора фтор, AIC кислоты и цитрата натрия может быть опасной мерой предосторожности, такой как работа в вытяжке и использование здравого смысла всегда должно приниматься при выполнении этой процедуры.