Многоцелевой параллельный подход для обработки Гена на элемент структуры Определение гриппа с использованием полимеразной PB2 субъединицы

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании многоцелевого подхода для структурированного определения целевого белка с помощью рентгеновской кристаллографии, начиная с одного гена или генетической последовательности в представленном здесь случае. Белком-мишенью является субъединица PB-2-полимеразы из гриппа А, ключевой компонент репликации вируса. Многоцелевой подход достигается путем параллельного проектирования и клонирования ряда генетических конструкций на основе последовательности одной мишени и другой информации, известной о белке.

Второй шаг заключается в проверке уровней экспрессии для каждой конструкции и выборе лучших из них для крупномасштабной экспрессии белка в клеточной культуре. Следующий шаг требует вскрытия клеток для удаления целевых белков из материала экспрессии и очистки каждого из них до очень высокой чистоты. Затем проводится серия испытаний кристаллизации с каждым белком, чтобы получить кристаллическую форму, пригодную для рентгеновских исследований.

Затем данные рентгеновской дифракции с высоким разрешением собираются на одном или нескольких кристаллах и используются для решения и уточнения карты электронной плотности, описывающей структуру каждого белка-мишени. Эти результаты позволяют визуализировать трехмерную структуру целевого белка на основе карты электронной плотности. Многоцелевой процессинг значительно увеличивает вероятность успеха в структурированном определении, предоставляя жизнеспособные альтернативы на каждом потенциальном препятствии на пути.

Параллельная работа с несколькими мишенями также очень эффективна, сокращая время и затраты на белок на каждом этапе. Потенциал увеличения скорости, с которой завершается структурированное определение лекарственных мишеней, позволит получить больше возможностей для разработки терапии в год. Хотя этот метод может дать ценную информацию в структурной биологии, высококачественный белок, полученный с помощью этих методов, может поддержать любые исследования на основе белка.

Каждый этап процесса имеет свою собственную науку и требует своего собственного опыта, но инвестиции в людей, инструменты и ноу-хау могут окупиться с лихвой, как только все части будут собраны. После того, как целевой ген и генный продукт выбраны для исследования, первым шагом является разработка нескольких генетических вариантов или конструкций. Программное обеспечение Gene Composer используется для проектирования этих конструкций на уровне белка вместе с соответствующим кодом на сконструированных синтетических последовательностях генов.

С помощью модуля просмотра выравнивания и модуля проектирования конструктов можно сравнить выравнивания белковых последовательностей и определить белковые конструкции, спроектировать, вставить ПЦР и векторные ПЦР терминальные праймеры или амперы. Затем используйте алгоритм преобразования белка в ДНК для обратной трансляции каждой аминокислотной последовательности в код на сконструированной последовательности нуклеиновой кислоты. Используйте соответствующий код в таблице использования для оптимизации последовательности выражения в определенной строке ячейки.

В данном случае это бактерии кишечной палочки. Как только последовательность гена-мишени будет готова, виртуально клонируйте и вставьте ген в подходящую векторную плазмиду для экспрессии бактерий. В данном случае модифицированный вектор PET 28.

Этот вектор содержит определенные компоненты, необходимые для экспрессии и очистки белка. Ген-мишень модифицируют для включения последовательности гистаминовой метки на N- или C-конце белка и последовательности расщепления, чтобы обеспечить удаление метки во время очистки. Вектор также обладает геном устойчивости к антибиотикам для тестирования экспрессии и ферментации.

Затем каждая генетическая последовательность белка-мишени создается с помощью стандартных методов синтеза генов при подготовке к клонированию трубчатой полимеразы с неполным первичным расширением, или клонирование трубки представляет собой стратегию клонирования на основе ПЦР, при которой ген-мишень амплифицируется праймерами, комплементарными к предполагаемому вектору. Этот метод использует неполную природу ПЦР на поздней стадии, в результате чего продукты ПЦР имеют вариабельные одноцепочечные концы. Я готовлю вставку PCR или IPCR, добавляя по пять микролитров прямых и обратных праймеров в каждую реакцию.

В планшете на 96 лунок в соответствии с картой планшета добавьте по два микролитра каждого полноразмерного синтетического гена в соответствующую лунку в соответствии с картой планшета. Добавив в каждую по 25 микролитров мастер-смеси PFU, хорошо циклируйте реакции 25 раз, используя следующие условия ПЦР. Денатурируйте при температуре 95 градусов Цельсия в течение 30 секунд.

Продолжайте при температуре 50 градусов Цельсия в течение 45 секунд и продлевайте при температуре 68 градусов Цельсия в течение трех минут. Амплификация фрагментов подтверждена гелевым анализом АГРОС продуктов IPCR. Успешные продукты IPCR представлены прочными лентами.

Менее желательные результаты часто проявляются в виде слабых или смазывающих полос в отдельной реакции. Экспрессия плазмиды амплифицируется методом векторной ПЦР или амплификации фрагментов VPCR, что подтверждается анализом геля AROS продуктов VPCR. После того, как продукты IPCR и VPCR амплифицированы, они добавляются в сливную пластину и помещаются в термоамплификатор для реакции слияния.

Успешно клонированные конструкции затем трансформируются в химически компетентные клетки кишечной палочки и хранятся в стеблях глицерина, чтобы начать серию тестирования экспрессии. Небольшое количество каждого образца из глицеринового запаса клонированной конструкции выносится на отдельную агаровую пластину. Планшет изготовлен из бактериального питательного бульона и маркера антибиотика канамицина, закодированного в векторе, который инкубируется в течение ночи при 37 градусах Цельсия на следующий день.

Начните предварительную подготовку для каждого образца, выбрав одну колонию из только что выращенной агаровой пластины. Используйте эту колонию для инокуляции 1,2 миллилитра туберкулезного бульона с добавлением мицина и глюкозы для параллельной обработки. Каждая предкультура выращивается в 96-луночном круглом блоке дна.

Выращивайте за ночь при 37 градусах Цельсия с встряхиванием со скоростью 220 оборотов в минуту. После ночного роста. Начните проводить индукционные культуры в небольших масштабах для каждого образца, используя 40 микролитров предварительной культуры для инокуляции.

1,2 миллилитра туберкулезного бульона. Дополнено 50 мг на миллилитр банки мицина и новагена ночной экспресс-системы. Во-первых, выращивайте индукционные культуры при температуре 20 градусов Цельсия в течение 48 часов, встряхивая при 220 об/мин сборочные клетки путем центрифугирования при 4000 единиц GForce в течение 15 минут.

Слейте надосадочную жидкость и храните гранулы при температуре минус 20 градусов Цельсия не менее одного часа перед дальнейшей обработкой после очистки. Анализ белка с реакцией расщепления и без нее методом капиллярного электрофореза с помощью штангенциркуля лабораторной системы CHIP 90 согласно протоколу производителя. В случае гриппа PB две белковые субъединицы 14 из 34 конструкций привели к образованию растворимого целевого белка и вступили в следующую стадию широкомасштабной ферментации.

Чтобы начать широкомасштабную ферментацию, инокулируйте 100 миллилитров бактериальной клеточной культуры бульоном, содержащим 50 миллиграммов на миллилитр. Может ли мицин из запасов глицерина вырасти за одну ночь при 37 градусах Цельсия? Встряхивая со скоростью 220 об/мин на следующий день, расширьте предкультуру, используя 10 миллилитров для инокуляции.

Один литр бульона, содержащий автоиндукционную среду и 50 миллиграммов на миллилитр, может содержать мицин в двухлитровой колбе. Вспученные культуры встряхивайте при температуре 37 градусов Цельсия примерно каждые 30 минут. Проверьте оптическую плотность культуры, измерив поглощение ультрафиолета на длине волны 600 нанометров.

Когда будет достигнута оптическая плотность 0,6, измените температуру встряхивающего инкубатора на 20 градусов Цельсия после желаемого времени роста. Удалите репрезентативный 10-миллилитровый квадрометр Али из каждой конструкции для проверки экспрессии. Соберите клетки центрифугированием при 5 000 единицах GForce в течение 15 минут.

Слейте надосадочную жидкость и заморозьте клеточную гранулу при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы начать эту процедуру, разморозьте и повторно суспендируйте клеточную пасту в буфере для лизиса с соотношением основного объема один к пяти. Энергично помешивайте в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Чистым шпателем отламывайте куски со стороны стакана. Механически излизуйте клетки на льду с помощью масонской соникатной сони. Осветите сырой лизат центрифугированием при 18 000 единицах GForce в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.

Соберите надосадочную жидкость и сохраните небольшую аликвоту для анализа, прежде чем приступать к крупномасштабной очистке. Подтвердите крупномасштабную экспрессию белка каждой культуры с помощью анализа геля на странице SDS. Этот репрезентативный результат страницы SDS показывает устойчивую экспрессию белка, примерно 50% растворимости и около 50% расщепления.

В этом случае метка гистидина была удалена вместе с добавленной меткой растворимости белка, которая была сконструирована в оригинальной конструкции. Никелевая смола используется для отделения целевого белка с уникальной гистаминовой меткой от всего остального клеточного материала, включая нативные бактериальные белки. Никелевую одноколонную получают путем промывки четырьмя объемами воды UE для удаления буфера хранения, за которым следует один объем буфера B и объем буфера с пятью колоннами.

Распараллеливание A для E уравновешивается с помощью производителя белка, который способен запускать несколько колонок одновременно. Загрузите каждый осветленный лизат, содержащий солюбилизированный белок с гистаминовой меткой, в отдельную колонку со скоростью два миллилитра в минуту, после чего последует несколько объемных промывок колонки с буфером А, соберите проточный буфер и сохраните для анализа. Элюируйте связанный белок в серии ступенчатых градиентов с буферами А и В при 95 до 5, от 60 до 40 и, наконец, 100% буфер В. Компоненты в буфере В конкурируют с гистамином за никелевую смолу и, таким образом, удаляют белок из колонки в заданном соотношении.

Соберите каждую фракцию элюирования отдельно. Здесь показана репрезентативная хроматограмма, полученная в результате прогона на столбце никелевого цвета. Проанализируйте протекающие фракции никелевого излучения, сырой лизат, осветленный лизат и никелевый протекание на странице SDS и сравните с поглощением ультрафиолета на глубине 280 нанометров, собранным во время очистки колонны.

Этот шаг определяет, была ли очистка успешной. Выберите и объедините фракции, содержащие целевой белок, для дальнейшей обработки. Рассчитайте общее количество белка на этом этапе с помощью теоретического коэффициента экстинкции белка, измерив поглощение ультрафиолета на глубине 280 нанометров и учитывая общий объем объединенных фракций.

Сохраните небольшой образец для анализа. Ген целевого белка был закодирован с определенной последовательностью, которая распознается ULP one как сайт расщепления, таким образом, добавление ULP one приводит к расщеплению между меткой гистидина и интересующим белком. Чтобы начать эту процедуру, добавьте один микролитр убиквитина, такого как протеаза, один на каждые пять миллиграммов белка, присутствующего в объединенных фракциях.

На этом этапе расщепленный белок переносят из буфера В в буфер А для дальнейшей обработки с помощью диализной трубки, диализуют белок против двух литров буфера А в течение четырех часов при четырех градусах Цельсия при перемешивании. Используйте отсечку молекулярной массы в 10 килодальтон для второго PB после диализа. Запустите еще одну страницу SDS геля целевого белка с одним присутствием ULP и без него.

Это позволит определить, было ли одно расщепление ULP успешным, и позволит выбрать лучшие фракции для дальнейшей обработки. Здесь показаны результаты нашей репрезентативной страницы SDS для трех конструкций полимеразы pb. Два маркера молекулярной массы субъединиц находятся в первой полосе.

Дорожки 2, 6 и 10 представляют собой объединенные белки из никелевых столбцов. Дорожки 3, 7 и 11 содержат проток расщепленного белка в буфере А из никеля 2 и дорожки 4, 8 и 12. Покажите удаление гистаминовой метки в буфере B из никеля два.

После удаления гистамина объединенные фракции из никеля-2 концентрируются. В этом случае используется колонка acere S 110 на 30 GL и уравновешивается 200 миллилитровым буфером SEC со скоростью потока 0,5 миллилитров в минуту с помощью пятимиллилитрового шприца, загружается образец в 10-миллилитровый контур отбора проб и начинается прогон колонки SEC. Контролируйте УФ-поглощающую хроматограмму на глубине 280 нанометров, собирая небольшие объемные фракции.

Запустите все соответствующие фракции SEC на странице SDS. Стандартный подход к испытаниям кристаллизации белка проводится методом сидячей капли, включающим диффузию пара. Нередки случаи установки двух или более разреженных матричных скринингов в самом начале для каждого целевого белка.

Чтобы начать этот процесс, предварительно заполните каждый резервуар 96-луночной компактной младшей кристаллизационной пластины 80 микролитрами в каждом условии на выбранном кристаллизационном экране, распределите по 0,4 микролитра белка в буфере SEC в каждую из 96 лунок. Затем добавляют по 0,4 микролитра кристаллизационного сита, обеспечивая полное перемешивание капли в каждом. Хорошо накройте все трио кристально чистой потолочной лентой, обеспечив полное уплотнение на каждой скважине, храните плиту при температуре 16 градусов Цельсия в спокойном месте, свободном от вибраций окружающей среды.

Периодически проверяйте кристаллизацию белка в течение следующих нескольких недель под микроскопом. Если кристаллы белка не появляются, установите новые тарелки с другими условиями и варьируйте концентрацию белка в конечной капле, чтобы повысить вероятность успеха перед сбором урожая. Охладите шайбу в стиле A LS в дозаторе, наполненном жидким азотом, и накройте крышкой, чтобы начать сбор урожая.

Разрежьте прозрачную ленту, закрывающую лунку с целевым кристаллом белка, до ближайшего пустого места. Хорошо добавьте 1,6 микролитра соответствующего кристаллизующегося состояния и соедините его с 0,4 микролитра этиленгликоля. Раствор 20% этиленгликоля в кристаллизующемся состоянии защищает кристалл белка.

Во время криозаморозки проанализируйте кристалл под микроскопом и выберите подходящую криопетлю для сбора, сопоставляя внутренний диаметр петли с максимальной шириной кристалла. Прикрепите криопетлю к магнитной кристаллической палочке и проведите петлю кристалла непосредственно из раствора лунки. Немедленно окуните криопетлю с собранным кристаллом в криопротектор, а затем погрузите в шайбу типа LS.

Чтобы мигнуть, заморозьте кристалл повторите для нужного количества кристаллов. После завершения сбора урожая с помощью палочки для шайбы наклейте магнитную крышку на шайбу, содержащую замороженные кристаллы с загнутыми язычками. Переверните шайбу вверх ногами для следующего шага.

Прикрутите толкатель шайбы к шайбе, затем передайте шайбу актеру KU и используйте ее, чтобы отбить крышку. Кристаллы в шайбе остаются замороженными в ванне с жидким азотом до тех пор, пока не будут готовы к рентгеновским дифракционным исследованиям с помощью программного обеспечения для получения изображений J Director. Задайте следующие параметры для щели кристаллического экранирующего луча под углом 0,5 градуса, расстояния детектора 50 миллиметров, шага изображения под углом 70 градусов и длины экспозиции 30 секунд.

Вот пример скриншота из программного обеспечения для получения изображений Во время скрининга кристалла на центральной панели показана наблюдаемая рентгеновская дифракция от репрезентативного кристалла, которая собирает достаточное количество изображений с высоким разрешением для полного набора данных, необходимых для определения трехмерной структуры. Стратегии клонирования и очистки белков, продемонстрированные в этом видео, привели к получению 14 очищенных PB, двух образцов, из девяти из которых были получены кристаллы, пригодные для дифракционных исследований. Собственный набор данных рентгеновской дифракции был собран на пяти из девяти конструкций с QK альфа-излучением с использованием сверхяркого рентгеновского генератора rigaku FRE plus с вращающимся анодом, оснащенного ossec variax hf, HF оптикой и детектором Saturn 944 plus CCD.

Здесь показано рентгеновское дифракционное изображение двухкомпонентной субъединицы полимеразы PB. Каждый набор данных был обработан, и в общей сложности было определено четыре структуры двух субъединиц PB. Каждая структура прошла экспертную оценку и была загружена в банк данных белков для публичного доступа.

На этом рисунке показаны ленточные диаграммы молекул в кристаллографической асимметричной единице. Из четырех структур PB две вторичные структуры окрашены в радужный узор с соответствующими кодами PDB. В этой таблице представлен анализ результатов для двух мишеней по гриппу PB с помощью методов, описанных в этой видеостатье.

Многоцелевой параллельный конвейер обработки для определения структуры гена проиллюстрирован в пять этапов: клонирование, растворимость, очистка, кристаллизация и определение структуры. Результаты нашего конвейера структурной биологии не только обеспечивают основу для структурных исследований, но и подпитывают дополнительные исследования, такие как функциональные анализы для подтверждения функции белка или биофизический скрининг новых соединений в MAR или SPR для определения новых отправных точек для разработки лекарств. Этот метод и инструменты, изобретенные вместе с ним, помогли структурным биологам проложить путь к обнаружению многих видов исследований, основанных на открытиях, включая структурный дизайн лекарств, который оказал огромное влияние на здоровье и болезни человека.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как многоцелевая параллельная обработка может значительно увеличить успех структурированного определения. Не забывайте, что работа в лаборатории структурной биологии может быть чрезвычайно опасной, и во время занятий в лаборатории всегда следует соблюдать надлежащие меры предосторожности, такие как использование СИЗ.