Визуализация бактериальный токсин индуцированные ответы с помощью флуоресцентной микроскопии Онлайн сотовых

Целью этой процедуры является визуализация реакции иммунных клеток на бактериальные токсины. Во-первых, токсин экспрессируется и очищается из золотых клеток BL 21. Как только активность и концентрация токсина подтверждены, токсин доставляется к иммунным клеткам.

С помощью микроинжектора и высокоскоростной микроскопии живых клеток проводится микроскопия. Анализ полученных изображений показывает кинетику реакции иммунных клеток на токсин в режиме реального времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как механизм активации инфламмосом.

Хотя этот метод может дать представление о реакциях иммунных клеток, опосредованных токсинами, он также может быть применен к другим стимулам, включая хемотаксические тракторы. Впервые идея этого метода возникла у нас, когда мы изучали взаимодействие бактерий с культивируемыми иммунными клетками и наблюдали очень вариабельные взаимодействия между бактериями и иммунными клетками. Начинают очистку стрептококкового лизина О или SLO с культуры клеток золота BL 21, содержащих PAG three SLO.

Его плазмида выросла до OD примерно 0,6. Чтобы вызвать экспрессию белка, добавьте в культуру пять миллилитров 20% OSes и встряхивайте при 2-25 об/мин при комнатной температуре в течение трех часов. Далее переложите бактерии в бутылку центрифуги объемом 500 миллилитров.

Затем вращайте культуру при температуре 12 000 раз G в течение 12 минут при температуре четыре градуса Цельсия после отжима. Супинат хранят гранулы при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение ночи или дольше, если это необходимо. Для очистки экспрессированного SLO добавьте в замороженную гранулированную пипетку вверх и вниз на 10 мл промывочный буфер с добавлением лизоцима Triton X 100 и фенилметилсульфурилфторида вверх и вниз на 15 минут.

Для Resus подвешивайте гранулу, удерживая образец на льду. Переложите ресуспендированную гранулу в 50-миллилитровую дубовую коньковую полипропиленовую трубку с круглым дном. Ультразвуковой обработкой лизата с помощью зонда на выходе 40% пять раз по 30 секунд каждый с интервалом в 30 секунд с 30 секундами на льду между ними.

Затем вращайте лизат ультразвука при температуре 39 000 G в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После отжима добавьте бактериальный супинат в один миллилитр промытого никеля NTA aros. После инкубации инкубируйте никелевый NTA арос и лизат в течение 2,5 часов при четырех градусах Цельсия с легким встряхиванием.

Раскатайте бусины, вращая при 400-кратном G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Обратите внимание, что все дальнейшие промывки и элюирование выполняются с этими настройками центрифугирования и в меньшей степени с учетом других параметров. После центрифугирования.

Соедините 30 микролитров супината с 10 микролитрами четырехкратного буфера SDS для образца в микроцентрифужной пробирке и сохраните его на льду для анализа чистоты. Затем выбросьте остатки средства на спине и промойте бусины четыре раза в буфере для промывки от вшей. И как только вас заинтересует центрифугирование в солевом буфере между каждой промывкой Начиная с этого момента, обязательно держите образец на льду все время.

SLO является очень чувствительным к окислительно-восстановительным веществам белком, и он быстро теряет свою активность, если нагреться до 37 градусов по Цельсию, даже если на короткий период времени. Чтобы разбавить белок SLO, добавьте в гранулы один миллилитр элюирующего буфера и пять микролитров одного молярного DTT, выдержите на льду в течение 10 минут. Затем центрифугируйте и соберите супинат в пробирку с маркировкой элуцианского числа.

Повторите этот процесс три раза, затем для истощения эндотоксина из белка SLO, добавьте к образцу 200 микролитров промытых поли смешиваемых сопряженных агрошариков, взвешенный буфер сольной соли и взбалтывайте при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. Затем вращайтесь со скоростью 10 000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. После отжима соберите надосадочную жидкость в новые пробирки для микроцентрифуг с маркировкой.

Соедините 30 микролитров каждого элюирования с 10 микролитрами, в четыре раза превышающим SDS буфер для пробы. Для анализа страниц SDS храните решения SLO на льду. Определите концентрацию белка и гемолитическую активность, если она удовлетворительна, вытяните SLOE в 5-10 микролитровых кватах, затем заморозьте на сухом льду и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Затем определяют конкретный лизис. Риз. Подвешивайте проверяемые клетки в два раза. Центрируйте шесть клеток на миллилитр в буфере RB с 20 микрограммами на миллилитр.

Пропидий йодид. Здесь тестируются клетки T 27 A. Добавьте по 100 микролитров ячеек в каждую лунку 96-луночного V-образного нижнего планшета в отдельных микроцентрифужных пробирках.

Последовательно разбавляйте SLO до двукратной конечной концентрации в буфере rb. Затем добавьте в клетки либо 100 микролитров токсина, либо 100 микролитров буферного RB и инкубируйте в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Типичные конечные концентрации варьируются от 2000 единиц на миллилитр до 31,25 единиц на миллилитр.

Прогоните клетки на проточном цитометре и соберите данные с помощью фильтров на fi, цетрин или pe. Сдвиг в один логарифм представляет временно проницаемые клетки, в то время как сдвиг в три логарифма указывает на мертвые клетки. Рассчитайте удельный лизис клеток, вычитая процент мертвых клеток в контрольной группе из экспериментального уравнения, показанного здесь за день до эксперимента, дважды центрируя пять макрофагов на стекле с коллагеновым покрытием.

Дно 35 миллиметровой посуды. Микроскоп, используемый для доставки токсинов, должен быть оснащен инвертированным предметным столиком, нагреваемым столиком, соответствующими кубиками фильтра излучения возбуждения и, при наличии, линзой Бертана. Самая сложная часть этой процедуры заключается в том, чтобы доставить иглу в неповрежденном виде к клеткам.

Чтобы обеспечить успех, мы используем линзу Бертрана, которая обычно используется для выравнивания, чтобы визуализировать иглу, когда мы проводим ее через фокальные плоскости. Микроскоп должен быть подключен к микроинжектору и управляться компьютером с достаточным объемом памяти для сбора и хранения данных, включить микроскоп и микроинжектор и дать нагретому столику нагреться до 37 градусов Цельсия в ожидании нагрева предметного столика. Пометьте клетки в течение 30 минут красителем при температуре 37 градусов Цельсия.

В зависимости от анализа маркировка может быть сделана пятью микролитрами, четырьмя или 2:00 AM в одном миллилитре, HBSS или двумя микролитрами кальция am в одном миллилитре полной среды, здесь используется четыре или два. Удалите клеточную среду и промойте клетки один раз PBS. Аспирируйте PBS и замените его одним миллилитром RPMI с добавлением двух миллимоляров хлорида кальция.

Установите чашку на микроскоп, сфокусируйте клетки с помощью светлого поля, затем отрегулируйте так, чтобы фокусироваться немного выше клеток. Далее соедините один микролитр токсина SLO с четырьмя микролитрами, 10 миллиграмм на миллилитр, DEXTRA 5 55 и шестью микролитрами воды. Затем центрифугируйте в 20 000 раз больше G в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Декстран используется для проверки того, что фемтонаконечник не забит G. С помощью микрозагрузчика загрузите два микролитра разбавленного токсина в фемтонаконечник сзади. Наденьте наконечник фемто на микроинжектор.

Затем отрегулируйте угол наклона инжектора так, чтобы наконечник располагался над центром ячеек, оставляя место для движения во всех направлениях, снимите предыдущие настройки для предела Z, который ограничивает, насколько низко может опуститься наконечник микроинжектора. Установите микроинжектор на впрыск в течение 0,5 секунды при давлении 120 фунтов на квадратный дюйм и противодавлении 20 фунтов на квадратный дюйм. Затем опустите кончик до тех пор, пока он не войдет в среду.

С помощью объектива Бертрана. Центрируйте кончик и следуйте за кончиком по мере его опускания ближе к ячейкам. Как только игла выйдет из фокуса, переключитесь обратно на обычную оптику.

Тень от иглы должна быть заметна в поле. Сосредоточьтесь над клетками и опускайте иглу до тех пор, пока она не сфокусируется. Затем сосредоточьте клетки и осторожно подведите иглу к ячейке.

После установки Z-предела для инъекции начните визуализацию и введите токсин. Затем поднимите иглу и переместите на новый участок клеток. Введите дополнительный токсин и продолжайте визуализацию после инъекции.

Переместите иглу в исходное положение, чтобы предотвратить любую нежелательную утечку токсина из иглы, используя метод, описанный в этом видео, от 10 до 7-10 до восьми единиц на миллилитр. SLO обычно получают с концентрацией белка четыре миллиграмма на миллилитр. На этой странице SDS показаны образцы бактерий до и после индукции токсина после очистки, и каждый из трех эллюцианов окрашивания камаси в синий цвет показывает, что индуцированный SLO был успешно очищен.

SLO — это полоса в 69 килодальтон для определения количества токсина, необходимого для лизиса T 27 A или D двух клеток. Клетки подвергали воздействию различных концентраций SLO в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия в присутствии йодида пропидия и исследовали с помощью проточной цитометрии. Специфический лизис определяли, как показано здесь.

250 единиц на миллилитр. SLO дает 50% лизис двух клеток T27 A и D. Сублитическая доза токсина при 10%-ном лизисе составит 62,5 единицы на миллилитр.

Эти значения важны для эталонной активности токсинов для оценки гибели клеток после воздействия токсина. Дермальные фибробласты человека инкубировали с гомодимером кальция и атерия с использованием набора для живых мертвецов от Life Technologies. После локализованного воздействия бактериального токсина, антролизина O.In этом изображении, кальций показан в зеленом цвете, а бромид атерия в красных областях, близких к микробиому, демонстрирует гибель клеток, типичную для потери кальция и поглощения гомодимера, в то время как в областях, удаленных от кончика, не будет обнаружено повреждений.

Микродоставка токсина также позволяет исследовать события в режиме реального времени, такие как поток кальция. Эти человеческие DCS, загруженные с 4:02 AM, подвергались воздействию SLO с постоянной скоростью потока с одновременным изменением изображения в реальном времени от зеленого к синему. Псевдоцвет указывает на повышение уровня цитозольного кальция.

SLO индуцирует быстрое увеличение цитозольного кальция, который распространяется по области чашки за счет локализованной доставки. Однако только клетки, расположенные близко к наконечнику микроинжектора, сталкиваются с реакторным токсином. Это демонстрирует как одну клеточную реакцию на токсин, так и пространственно ограниченную область доставки токсина для разрешения событий в измерении zdi.

Микродоставка сочеталась с высокоскоростной 3D конфокальной микроскопией. На этом наборе изображений показаны дендритные клетки после инъекции токсина. Они были предварительно инкубированы с анти-CD 11 C, конъюгированным с ПК, показанным зеленым цветом для маркировки плазматической мембраны.

Как видно на рисунке, микровезикулы высвобождаются после доставки токсина. В рамках процесса клеточной репарации молекулы токсина концентрируются на пузырьках, которые выделяются для выведения токсина. После освоения микроскопия может быть выполнена за 45 минут.

Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о том, что токсин должен оставаться холодным перед смешиванием с клетками и проверить гемолитическую активность. Хороший. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как измерять кинетику реакции иммунных клеток на бактериальные токсины в реальном времени с помощью микроскопии живых клеток.